一、代谢通路分析的科学意义

二、代谢通路分析的实施流程

（一）分析平台选择

（二）数据准备与上传

1. 数据文件规范
   需构建包含样本信息、分组信息及代谢物定量数据的矩阵文件，格式为制表符分隔的 TXT 文件或逗号分隔的 CSV 文件。关键要求包括：
   • 明确标注样本名称及对应的分组信息，确保数据的可追溯性；
   • 代谢物名称需规范化，避免使用希腊字母（如 α、β 需替换为 alpha、beta）等特殊字符，以保证与数据库的匹配准确性。
2. 数据格式校验
   上传数据后需进行格式检查，主要包括：
   • 剔除非数值型数据、异常符号及标点，确保数据矩阵的一致性；
   • 对缺失值及零值进行标准化处理（默认替换为对应变量最小正值的 1/5）；
   • 针对数据库匹配异常的代谢物（通常标黄显示），通过 “View” 功能进行近似搜索，手动选择最佳匹配项，并关联其在 KEGG 等数据库中的注释信息（如化合物 ID、代谢途径归属）。

（三）参数设置与分析执行

1. 核心参数配置
   在数据分析模块中，需根据研究目标设置关键参数：
   • 可视化方法：选择散点图（适用于通路富集结果的直观展示）；
   • 富集分析方法：采用全局测试（Global Test），通过统计学模型评估代谢物在通路中的富集程度；
   • 拓扑分析方法：选用中介中心性（Betweenness Centrality），量化代谢物在通路网络中的拓扑重要性；
   • 参考数据库：选择人类 KEGG 数据库（或根据研究对象选择对应物种数据库），并设定参考代谢组为所选路径库中的全部化合物，以确保分析的全面性。
2. 结果获取
   分析完成后，可下载包含通路富集统计量、拓扑参数及可视化图形（气泡图、通路图）在内的结果文件，用于后续解读。

（四）结果可视化与解读

1. 气泡图解读
   气泡图是代谢通路分析的核心可视化结果，通过二维坐标整合通路的富集显著性与拓扑重要性：
   • 纵坐标为 -log (P) 值（P 值为富集分析的统计学显著性，-log (P) 越大，表明通路富集的统计学意义越显著，颜色越深，通常以红色表示高显著性）；
   • 横坐标为 Pathway Impact 值（由拓扑分析计算得出，反映代谢物在通路中的功能重要性，值越大，气泡越大，表明该通路在代谢网络中起关键作用）；
   • 判定标准：位于气泡图右上角的通路（-log (P) 大且 Pathway Impact 值高）兼具高显著性与重要功能，是后续研究的核心候选通路。
2. 通路图解读
   通路图直观展示差异代谢物在具体通路中的位置及相互作用：
   • 代谢物节点：鼠标悬停可显示通用名称，点击节点可查看该代谢物的箱型图（展示各组含量差异）、重要性评分（Importance）及数据库链接（DB Links）；
   • 颜色编码：节点颜色从黄色到红色渐变，代表代谢物的显著性水平（红色表示显著性最高），浅蓝色节点表示该代谢物未在当前数据中检测到，作为通路背景参考。 

三、总结与展望