免疫组化是个苦活，时间长，步骤多，还要经常接触有毒致癌物质。大家辛辛苦苦如何才能染出了漂亮的片子，并分析出得出自己想要的结果呢？

免疫组化，免疫组织化学技术(immunohistochemistry)，是一项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。

免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。

石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴露有影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。

免疫组化步骤详解

1、在60°烤箱烤片30~60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固贴在玻片上。做切片是免疫组化的前提切片子最好是找专业培训郭的人员切片，片子的厚薄均匀，切片的完整，无褶无刀痕。

2、脱蜡水化，依次放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低）各2min，水。然后用自来水洗一下，但不要直接对着切片冲洗。

3、抗原修复，小编用的是高压热修复，ph6.0的柠檬酸盐缓冲液，一定要全部浸泡切片，等高压锅冒气后5min结束，自然冷却，温度剧降可能引起脱片哦。3%H202避光浸泡15min。

4、用免疫组化油笔围绕组织画圈，接下来就能看见它的功效了。PBS洗5min*3次。PBS会被锁在画的圈中，不会流干，保证不干片。

免疫组化结果分析

很多时候，我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。如何正确地分析，得出理想的结果。

结果分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和评分法。

前者是在40*光镜下，随机10个视野下计数阳性着色细胞；

后者则是在光学显微镜下按染色程度（0分阴性着色，1分淡黄色，2分浅褐色，3分深褐色）和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。

1.对照染色

没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。对照一般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身对照。一般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照就足够了。

2.定位

抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。

3.肉眼定量

因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。免疫组化的半定量一般就分为三级：弱（+），中（++），强（+++）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱（+）=1，中（++）=2，强（+++）=3。至少随机观察5-10个视野。然后根据（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3计算出数值；总数值<1.0者为（+），1.0-1.5者为(++), >1.5者为(+++)。

4.图像分析软件

如果要进行精确定量的话，就要用到图像分析软件。图像分析软件类型很多。

一款图像分析软件： Image J。NIH开发的免费软件。一般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了。现在已经开发到了1.50版。网上可以免费下载。其界面非常简洁，如下图所示：

现在，根据一个实例来看看如何用Image J来进行图像分析。如下图所示，我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。那么，如何用Image J来计数细胞的个数呢？

首先，要把彩色的图像转换成黑白图像。

步骤如下：Image→Type→16-bit。转换成黑白图像后，将要计数的部分用高亮标示出来。

步骤如下：Image→Adjust→Threshold。然后拖动鼠标，直到所有的细胞被标示出来。

有时候2个细胞靠得比较紧密，会被计数为1个细胞。这个时候可以采用Image J的水洗功能。

步骤如下：Image→Binary→Watershed。如下图的蓝色箭头所示，这些是本来计数成一个的细胞，经过水洗之后，更加精确地被计数成2个细胞。

然后，就可以正式开始分析了。

步骤如下：Analyze→Analyze Particles。在得出最后的结果之前，还有一些选项需要选择。

如果想要计数全部的细胞，那么Size项里面选择“0-infinity”。Circularity的默认值为“0.00-1.00”。一般就取默认值。

最后的结果如下图所示。软件自动测量了每个细胞的大小。这里因为是二维图像，所以就是每个细胞的面积。然后计数了一共有72个细胞，总面积为21286.00，平均大小为295.64。

labex提供技术： 多重免疫组化