蛋白质相互作用（PPI）是细胞信号传导、物质代谢、免疫调控的核心分子基础，蛋白结合异常会直接驱动肿瘤、自身免疫病、神经退行性疾病等各类病变。完整的互作研究需要遵循「预测→初筛→体内复合物验证→原位可视化→体外直接结合→亲和力定量」分层逻辑，不同实验的证据层级、适用场景差异极大。本文系统梳理 11 种通用 PPI 研究手段，区分各技术的实验原理、优缺点与适用实验阶段，方便科研人员按需组合搭建完整验证链条。
1、IP 免疫沉淀（基础富集工具）
IP 是所有免疫类蛋白实验的底层技术，依靠靶蛋白特异性抗体结合裂解液内目标蛋白，搭配 Protein A/G 磁珠捕获抗体 - 蛋白复合物，经洗涤洗脱获得高纯度靶蛋白。该技术仅用于单一蛋白富集、表达量鉴定，无法证明蛋白存在相互作用，仅作为 Co-IP、质谱等下游实验的前处理富集步骤，不具备互作验证能力。
2、Co-IP 共免疫沉淀（体内复合物验证）
Co-IP 是 IP 的延伸体内互作验证手段，使用非变性裂解液保留细胞原生蛋白复合物结构；通过靶蛋白 A 的抗体富集 A 蛋白时，可共沉淀细胞内与其结合的互作蛋白，再用 WB 检测候选蛋白 B，证实二者在胞内存在物理关联。该方法仅能证明蛋白在胞内形成复合物，无法区分是直接结合还是第三方蛋白桥接形成的间接互作，需搭配体外实验或原位 PLA 技术进一步细分验证。
IP 与 Co-IP 核心区别：IP 只纯化单一靶蛋白，用于蛋白定量、富集；Co-IP 同步富集靶蛋白及其胞内结合搭档，用于细胞内互作关系初筛。
3、GST Pull-down（体外直接互作验证）
体外重组蛋白验证金标准，将靶蛋白融合 GST 标签固定在 GSH 磁珠作为诱饵，与纯化蛋白或细胞上清孵育，仅存在直接物理接触的蛋白会被捕获，可完全排除胞内其他蛋白介导的间接结合干扰。产物可通过 WB 验证已知配对，或送质谱筛选全新互作分子，常用于明确两个蛋白是否直接结合、定位互作结构域；缺陷是重组蛋白缺少细胞内天然翻译后修饰，与生理环境存在差异。
Co-IP vs GST Pull-down 对比：Co-IP 反映细胞内天然复合状态，分不清直接 / 间接结合；Pull-down 体外重组体系，只捕获直接互作，适合机制细分验证。
4、Far-Western Blot（膜杂交式直接互作检测）
兼具 WB 分离与 Pull-down 验证优势，先通过 SDS-PAGE 分离蛋白并转印至 PVDF 膜，再用带 GST/His 标签纯化诱饵作为探针孵育膜蛋白；若二者直接结合，抗标签抗体会产生特异性条带。无需针对待测蛋白制备一抗，适合快速批量验证多组重组蛋白的直接结合。
5、酵母双杂交 & 酵母文库筛选（高通量互作初筛）
基于 GAL4 转录因子拆分体系的遗传学筛选工具，将 BD 结构域融合诱饵蛋白、AD 结构域融合候选蛋白；若 X、Y 蛋白在酵母细胞核内结合，BD 与 AD 空间靠近重构完整转录因子，激活 HIS3、LacZ 等报告基因。分为点对点验证、cDNA 文库筛库两种模式，优势是高通量挖掘未知互作，缺点假阳性偏高，初筛结果必须细胞水平回证。
6、MST 微量热泳动（亲和力定量）
依靠温度梯度下分子迁移速率变化定量互作强度，荧光标记靶蛋白与梯度浓度配体混合，分子结合后分子量、水化层发生改变，迁移曲线随之偏移；软件拟合曲线可精准输出 Kd 解离常数、结合计量比、热力学参数，微量样本即可完成亲和力动态检测，无需芯片固定步骤。
7、SPR 表面等离子共振（实时动力学定量）
无标记实时分子互作技术，诱饵蛋白固定在金芯片表面，待测分子流经芯片时，结合反应改变芯片折射率，实时记录 RU 信号变化曲线，同步获取 kon、koff、Kd，适配蛋白、多肽、小分子、核酸多类分子定量。
8、高通量蛋白芯片（大规模互作全景筛选）
将数千种纯化蛋白、捕获抗体高密度固定在固相基质，标记待测样本孵育后扫描荧光信号，单次实验同步检测上千种蛋白互作、修饰与表达，适合疾病模型大规模互作网络无差别初筛。
9、邻近生物素标记（APEX/BirA）
诱饵蛋白融合生物素连接酶 BirA，胞内添加生物素后，诱饵 40nm 范围内全部蛋白被生物素标记；裂解后链霉亲和素磁珠富集标记蛋白并送质谱，专门捕捉 Co-IP 难以捕获的弱互作、瞬时膜蛋白互作。
10、PLA 邻位连接技术（原位可视化互作验证）
技术原理
PLA 全称邻近连接实验，依托双特异性一抗 + DNA 偶联探针 + 滚环扩增（RCA）体系实现原位互作检测：分别用不同种属一抗识别两种靶蛋白，偶联寡核苷酸的 PLA 探针随之结合；仅当两个蛋白空间距离＜40nm（发生互作），探针 DNA 才能互补成环，经扩增后产生单分子荧光斑点，单个荧光点对应一对蛋白互作事件，可在细胞、石蜡 / 冰冻组织切片直观展示互作发生的亚细胞位置。
PLA 与 Co-IP 核心对比
1、样本形式：Co-IP 需要裂解细胞 / 组织破坏空间结构，仅能获取裂解液混合样本；PLA 使用完整细胞、组织切片，全程保留细胞形态与蛋白亚细胞定位。
2、信号特征：Co-IP 只能证明两种蛋白存在胞内复合物，无法区分直接 / 间接互作、无位置信息；PLA 可同时完成互作定性 + 空间定位，区分细胞膜、线粒体、细胞核等区域的互作差异。
3、互作捕捉能力：Co-IP 仅能稳定富集高丰度强结合复合物，瞬时、弱互作极易在洗涤步骤丢失；PLA 单分子级灵敏度，可捕捉低丰度、瞬时弱蛋白结合。
4、结果输出：Co-IP 最终为 WB 条带，仅能判断有无结合；PLA 输出荧光成像图，可统计斑点数量实现互作程度定量。
5、局限性：Co-IP 操作流程成熟、可搭配质谱筛未知互作；PLA 只能验证已知配对蛋白，无法用于全新互作筛选。
适用场景
验证膜蛋白、细胞器接触位点、低丰度转录复合物原位互作，联合 Co-IP 形成「裂解液复合物验证 + 原位空间可视化」完整证据链，大幅提升文章数据完整性。
11、PPI 生物信息数据库（前期预测工具）
主流数据库包含 STRING、BioGRID、IntAct、UniProt、HPRD，整合全球已发表互作数据与预测算法，输入靶基因即可可视化互作网络、置信度与关联通路，仅作为课题前期预筛选，所有预测必须湿实验验证。
原位可视化蛋白互作 PLA 邻近连接实验服务去哪里做？
乐备实 LabEx 可提供全套 PLA 邻位连接检测服务，对应服务货号 LX-PLA，支持细胞爬片、石蜡、冰冻组织多种样本，配套方案设计、样本前处理、荧光显微成像、斑点定量统计一站式交付，可搭配 Co-IP、Luminex 多因子等平台联合开展蛋白互作完整机制研究，适配肿瘤、免疫、代谢、铁死亡等高分课题数据产出。
| 货号 | 产品名 |
|---|---|
| LX-PLA | PLA 可视化蛋白互作服务 |
| LXPLAC24-1 | PLA 可视化蛋白互作服务 (24 孔板) |
| LXPLAC12-1 | PLA 可视化蛋白互作服务 (12 孔板) |
| LXPLAC06-1 | PLA 可视化蛋白互作服务 (6 孔板) |
| LXPLAT00-1 | PLA 可视化蛋白互作服务 (组织切片) |
| LXPLAM00-1 | PLA 可视化蛋白互作服务 (组织芯片) |
沪公网安备31011502400759号
营业执照(三证合一)
