PCR
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聚合酶链反应或多聚酶链反应PCR
聚合酶链反应或多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR),能够对特定的DNA片段体外进行快速扩增。PCR技术可以应用于基础研究如:基因表达,基因分型,分子克隆,测序等,还可以应用于医学、法医学和应用科学。
 原理:
①变性(Denaturation)
双链DNA在93℃左右,氢键断裂形成单链结构。
②退火(Annealling)
引物会和单链DNA结合,温度逐渐降低通常低于引物熔点5℃,避免形成引物二聚体和非特异性结合。
③延伸(Extension)
DNA聚合酶结合上引物沿着DNA链合成互补链。
 应用方向:
①基因表达
不同细胞类型、组织和生物体在不同的时间点基因表达具有明显的差异。不同的细胞和动物模型与正常组相比也具有较大的基因差异。可以通过PCR对基因表达进行定量找出差异基因。
②基因分型
PCR能够检测生物体中等位基因的序列差异,可以明确基因小鼠的基因分型和对遗传病中的突变进行分析。
③分子克隆
PCR能够克隆目标DNA片段,然后插入到特殊的兼容载体中。能够过表达目的基因以明确该基因的作用。
④测序
测序技术是指测定核酸或氨基酸等生物分子序列的技术。人类经过了100多年的时间,通过测序技术获得了基因密码。目前最常见的是二代测序又称高通量测序基于PCR和基因芯片的DNA测序技术。
⑤医学
PCR技术在基础研究领域和临床诊断中都发挥着重要作用。新冠病毒核酸检测主要用到荧光定量RT-PCR技术。
 结果展示:
①PCR扩增曲线
基线:PCR扩增反应的初期,荧光信号变化不大,接近一条直线,称为基线。
阈值线:阈值线就是在扩增曲线上人为设定的一条与扩增曲线相交的一条线。
CT值:每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所对应得循环数,若起始基因数量多,则CT值小,反之亦然。
②PCR熔解曲线
反应产物单一,曲线会出现一个尖峰;如果有二聚体或者非特异性的扩增,就会出现至少两个峰。
 实验基本步骤:
①中心法则
遗传信息从DNA传递给RNA,再从RNA翻译为蛋白的过程。
②提取RNA
从细胞或者组织中提取RNA是PCR实验的第一个步骤,常规的是用Trizol试剂,其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质能够破碎细胞并抑制细胞释放核酸酶,从而保持RNA的完整性。
③反转录
是以RNA为模板,通过反转录酶,合成DNA的过程。遗传信息从RNA反转到DNA与传统的中心法则相反因此称为反转录。
④体外扩增
dNTP为反应原料,在DNA聚合酶的作用下,以DNA单链,引物为模板按照碱基互补配对原则进行体外扩增。
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