单细胞测序
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单细胞测序概述
全基因组测序(Whole Genome Sequencing)是指人类的全基因组测序,将基因组序列完整检测出来。多细胞生物,细胞和细胞之间是有差异的,例如肿瘤组织中心的细胞和周围的细胞基因组信息是不一样的。单细胞测序是获得单个细胞遗传信息的测序技术,这种技术具有特异性。
原理
①获取单个细胞
早期获得单细胞的方式主要包括:有限稀释法,流式分选法,激光切割法,显微操作法。随着技术发展,主要通过微流控芯片将单个细胞捕获至油滴。
②建库
基因组测序需要先将其打断成300 ~ 500bp的长度,会在3'端加上特异性碱基A,最后再加上adapter主要包括测序时所需要的引物序列和建库扩增时的引物序列。
③桥式PCR
将上述DNA样品调整到合适的浓度进行桥式PCR扩增。PCR过程中,序列是呈现桥状,经历一轮之后序列扩增1倍,如此反复会的到一个相同序列的簇。
④测序
加入引物和荧光标记的四种碱基A,T,C,G,可以激发出不同的颜色。在测序过程中,每一轮测序,都只会加入一个碱基。
 应用方向:
①细胞图谱构建
单细胞测序获得单细胞转录组图谱,根据结果进行细胞类型聚类,分析研究机体中不同细胞亚型的功能,发现各个细胞之间的互作关系。
②细胞亚群细化
单细胞测序获得的细胞基因表达情况和已知的细胞进行对比,能够进一步对细胞细化发现新的细胞亚群。
③干细胞发育及分化研究
干细胞具有无限的自我更新的能力,能够至少产生一种高度分化的子代细胞。单细胞测序能够分析干细胞发育分化过程中细胞的异质性,描绘出干细胞发育分化的图谱。
   
BD Rhapsody: 单细胞分析工作流程

 1. BD Rhapsody 核心技术之微孔板

一个微孔 =   一个单细胞 + 一个磁珠

BD Rhapsody Express单细胞分析系统提供的单细胞分割,以微孔为基础,功能强大。
●   最低限度一套台式设备,没有射流泵
●   当细胞在重力作用下沉入微孔时,可以对其进行温和的处理
●   每个BD Rhapsody微孔板均包括一个超过22万个分区的微孔阵列
●   BD Rhapsody"微孔板体积约为600μL,稀释细胞悬浮液可直接装入微孔板,无需将其浓缩到非常小的体积
●   由于没有微流通道,因此不需要担心通道堵塞的问题
●   微孔经过特殊处理,以防止细胞粘附在表面,并进行深入的质量控制

Rhapsody利用微孔进行单细胞分离,属于Microwell-seq。 20万个微孔的尺寸被设计成一个微孔恰好可以容纳一个bead+一个细胞。

 2. BD Rhapsody核心技术之Barcoded Bead

 3. 单细胞文库制备及测序


Single cell isolation and capture流程图

 4. BD Rhapsody技术优势

成本更低—— 靶向基因检测,避免看家基因占用的大量测序数据,大大节省了测序和分析成本。

超高细胞捕获效率—— 有效细胞捕获率60%,远高于市场上目前所有大通量单细胞转录组测序技术。

罕见转录本,更高检出率—— 靶向定制panel,选定特定基因组合,提高UMI计数效率,罕见转录本检测阈值更低。

克服PCR,扩增偏差——引入单细胞测序金标准,BD分子标签,降低非特异性表达。

实理更高的分辨率——可以分辨更精细、微观的细胞群和细胞亚种群。

反转录的磁珠,超常稳存储——完整cDNA可在磁珠微球结构保存长3月(4度),随用随取。

灵活分样组合——提高样品通量(最多可12个样本同时建库,可等分,可随机组合);又可以同时进行单细胞蛋白和转录组联合检测,大大降低成本的同时,也为单细胞多组学研究提供了更高效的平台。

5. BD Rhapsody产品线overview

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