一、引言
在生命科学研究与医学诊断领域，细胞免疫反应的精准检测对疾病机制解析、治疗效果评估及新型疫苗研发意义重大。酶联免疫斑点检测（ELISpot）技术融合细胞培养与 ELISA 技术优势，实现单细胞水平细胞因子分泌检测，为科研与临床提供高灵敏度、高特异性解决方案。
二、ELISpot 技术原理
ELISpot 原理与 ELISA 相似但有创新。细胞受刺激后局部产生细胞因子，被预包被在 PVDF 孔板等固相载体上的特异单克隆捕获抗体捕获。细胞分解后，捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。经 BCIP/NBT 底物孵育，PVDF 孔板出现 “紫色” 斑点，每个斑点对应一个分泌该细胞因子的活性细胞，通过 ELISpot 分析系统可得出分泌特定细胞因子的细胞频率。
三、与传统 ELISA 的区别
（一）检测方式不同
ELISA 通过酶标仪测吸光度，结合标准曲线得可溶性蛋白总量；ELISpot 则在细胞分泌蛋白位置形成可辨斑点，可人工或通过分析系统计数。
（二）检测灵敏度差异
ELISpot 为单细胞水平检测，灵敏度远超 ELISA 和有限稀释法，能从 20 万 - 30 万细胞中检出 1 个分泌目标蛋白的细胞；ELISA 仅能测细胞因子总体含量，无法实现单细胞分辨。
四、ELISpot 的实验步骤
（一）准备工作
选用 PVDF 膜微孔板，准备捕获抗体、二抗、亲和素、底物等试剂，获取并处理待检测细胞样本（如 PBMC）并计数。
（二）包被抗体
稀释捕获抗体后加入微孔板，4℃孵育过夜，洗涤去除未结合抗体。
（三）细胞刺激与培养
将细胞样本加入包被好抗体的微孔板，加刺激剂，在 37℃、5% CO₂条件下孵育 18-24 小时。
（四）检测步骤
培养结束后洗涤微孔板，依次加入生物素标记二抗、碱性磷酸酶标记亲和素孵育，最后加底物孵育至斑点显现。
（五）结果分析
用 ELISpot 分析系统计数斑点，计算细胞频率，也可人工显微镜计数辅助验证。
五、R&D 的 ELISpot 试剂盒
（一）单因子 ELISpot 试剂盒
专用于检测分泌一种细胞因子的细胞，如疫苗研发中检测免疫细胞分泌 IFN-γ，为评估细胞免疫应答强度提供数据。
（二）双色 ELISpot 试剂盒
可检测分泌两种细胞因子的细胞，如同时检测 Th1 和 Th2 型细胞因子分泌细胞，助力研究免疫反应类型与平衡。
（三）双色 FluoroSpot 试剂盒
基于荧光检测，灵敏度和分辨率更高，适用于微量细胞因子分泌细胞检测。
（四）ELISpot 开发试剂盒
含检测必需基本组分，经济灵活，方便研究者根据需求开发检测方法，适用于罕见病相关细胞因子研究。
六、ELISpot 技术的应用领域
（一）疫苗研究开发
是评估疫苗诱导免疫反应的重要工具。在艾滋病疫苗研发中，检测 HIV 特异性 T 细胞分泌细胞因子情况，判断疫苗激活细胞免疫的效果；乙肝疫苗研发中，检测针对病毒抗原的特异性免疫细胞以评估效果；肿瘤疫苗研发中，凭借高灵敏度检测微弱免疫反应，推动研发进程；mRNA 疫苗研发中，通过检测炎症因子评价其免疫原性和安全性。
（二）临床方面
疾病诊断：感染性疾病（如肺结核）中，检测针对病原体抗原的特异性 T 细胞辅助诊断；自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮）中，检测自身反应性 T 细胞分泌细胞因子情况，助力了解发病机制。
病因查找：对不明原因免疫功能异常患者，检测多种抗原刺激下的免疫细胞反应，如过敏性疾病中确定过敏原。
治疗和用药：肿瘤免疫治疗（如 CAR-T 疗法）中，分析治疗后特异性免疫细胞变化评估效果；药物研发中，检测药物对免疫细胞功能的影响，为评价其安全性和有效性提供参考。
（三）基础研究方面
人体免疫学功能研究：研究 CD4⁺、CD8⁺T 细胞等亚群在不同刺激下的细胞因子分泌，解析免疫系统调节机制。
疾病免疫学研究：肿瘤研究中揭示肿瘤细胞逃避免疫监视及免疫系统攻击肿瘤的机制；自身免疫性疾病研究中探索致病性 T 细胞应答机制，寻找治疗靶点。
七、结论
ELISpot 技术凭借单细胞检测能力、高灵敏度和特异性，在疫苗研发、临床诊疗及基础免疫学研究中应用价值巨大。随着技术发展，其试剂盒更丰富，操作更简便，在生命科学和医学领域前景广阔，有望为解决更多难题提供支持。
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