一、研究背景与目的

结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）作为全球常见恶性肿瘤之一，其发生发展机制尚未完全阐明。肿瘤微环境在结直肠癌进展中扮演关键角色，其细胞组成、空间分布及分子表达模式的动态变化深刻影响肿瘤的发生、侵袭及免疫逃逸。近年来，空间多组学技术的发展为在组织原位解析基因表达的空间异质性提供了有力工具。DSP空间多组学技术应用通过结合激光捕获显微切割与高通量多重分子检测，实现对组织切片中特定形态区域的高精度分子分析。

本研究旨在利用DSP（Digital Spatial Profiler）空间多组学平台，系统揭示早期结直肠癌发生过程中不同组织学区域的上皮与基质细胞的转录组动态变化，识别潜在的生物标志物，并探索肿瘤微环境免疫调控机制，为结直肠癌的早期诊断和靶向治疗提供新思路。

二、研究思路与方法

本研究整合空间转录组学、免疫组化验证及生物信息学分析，构建多维度研究框架。首先，利用DSP技术对早期结直肠癌组织切片中9个具有不同组织病理学特征的感兴趣区域（Region of Interest, ROI）进行高精度分子表型分析。每个ROI内分别选择上皮细胞标志物PanCK阳性区域与间质细胞标志物Vimentin阳性区域，实现对上皮与基质细胞组分的空间分辨转录组分析。

通过降维聚类、差异表达分析及功能富集分析，系统比较不同病理区域中两类细胞的基因表达特征。对筛选出的候选基因进一步采用免疫组织化学（IHC）进行蛋白水平验证，以确认其作为生物标志物的潜力。同时，采用免疫细胞反卷积算法推断各ROI中免疫细胞组成的相对比例，结合WikiPathways、基因集富集分析揭示关键信号通路变化。为深入解析肿瘤相关巨噬细胞表型转变，研究还整合成像质谱流式（IMC）技术和已发表单细胞RNA测序数据，系统揭示髓系细胞在结直肠癌演进过程中的动态变化。

三、研究结果

3.1 早期CRC空间转录谱揭示上皮与基质区域基因表达异质性

基于DSP平台的空间转录组分析显示，不同组织学区域中上皮细胞与基质细胞均呈现显著不同的基因表达特征。主成分分析及t-SNE降维结果明确区分了来自不同病理分区的样本，提示区域特异性转录程序在结直肠癌早期演进中已被激活。差异表达分析识别出多个在不同病理区域间表达显著变化的基因，如与细胞增殖、上皮间质转化及免疫调节相关的关键分子。这些差异表达基因可能作为结直肠癌恶性转化过程中的候选生物标志物。

Fig.1 早期CRC空间DSP转录谱分析

为进一步验证候选基因的蛋白表达水平，研究者对筛选出的差异基因进行了免疫组化验证。结果显示，这些基因在蛋白水平的表达变化与转录组数据高度一致，支持其作为结直肠癌临床诊断和分期辅助标志物的潜力。

Fig.2 早期结直肠癌中候选生物标志物的差异基因及蛋白

3.2 功能富集分析揭示上皮与基质区室特异性生物学过程

通过WikiPathways数据库进行通路富集分析，共识别出7个与恶性转化程度相关的通路模块（C1–C7）。上皮细胞主要富集于C1、C2和C4通路模块，涉及细胞增殖、DNA损伤修复和代谢重编程等过程；基质细胞则显著富集于C5、C6和C7模块，主要包括免疫抑制、血管生成和细胞外基质重构等通路。C3模块在上皮和基质细胞中共同富集，其通路多与肿瘤进展和转移相关。该结果表明，空间多组学在肿瘤微环境研究中能够有效区分不同细胞群的功能状态，揭示上皮与基质区室在结直肠癌发生中的协同与异质性作用。

3.3 结直肠癌进展伴随免疫微环境重塑与CD47-SIRPα信号上调

免疫反卷积分析显示，从正常组织到癌组织，整体免疫细胞浸润水平下降，而成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞的比例显著增加。差异表达与通路富集分析进一步表明，CRC发生早期伴随先天免疫反应的激活，且CD276（B7-H3）和SIRPA（SIRPα）在高级别增生区域和癌区域的基质中表达上调。

Fig.3 结直肠癌进展过程中的免疫变化

通过IHC在蛋白水平验证CD47及其配体SIRPα的表达，发现二者从正常黏膜、低级别增生、高级别增生至浸润癌的表达逐步增加，提示CD47-SIRPα轴作为免疫检查点信号在结直肠癌免疫微环境调控中发挥重要作用，可能成为结直肠癌生物标志物发现与验证的潜在靶点。

Fig.4 CD47以及SIRPα 蛋白表达

3.4 巨噬细胞表型转变表征结直肠癌演进过程

利用成像质谱流式技术（IMC）对巨噬细胞表面标志物（CD68、CD163、HLA-DR、CD204）进行空间蛋白组分析，发现结直肠癌进展过程中巨噬细胞亚群组成发生显著变化。结合已发表单细胞数据集进行整合分析，结果显示在从正常组织经发育异常向癌转变的过程中，髓系细胞浸润增加，巨噬细胞表现出从促炎型HLA-DR⁺ CD204⁺亚群向抑炎型HLA-DR⁻ CD204⁺亚群的极化转变。这一转变可能与肿瘤免疫抑制微环境的形成密切相关。

Fig.6 巨噬细胞亚型在从正常组织到癌症的进展过程发生转变

四、主要结论

本研究综合利用DSP空间多组学、成像质谱流式及生物信息学方法，系统揭示了早期结直肠癌发生过程中的空间转录组动态和免疫微环境演变。研究发现上皮与基质区室在恶性转化中激活不同的生物学过程，并识别出多个具有潜在临床应用价值的生物标志物。特别地，研究揭示了CD47-SIRPα信号轴在结直肠癌免疫微环境中的上调现象，以及巨噬细胞从促炎向抑炎表型的转变，为结直肠癌的免疫治疗提供了新的靶点与策略。

空间多组学技术的应用不仅深化了对结直肠癌发病机制的理解，也展示了其在肿瘤生物标志物挖掘和微环境解析方面的广阔前景。

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