概述

酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种广泛应用于生物医学领域的免疫分析技术。其检测结果的准确性与可靠性依赖于优质试剂、精密仪器及规范化的操作流程。本文基于板式ELISA的常规操作流程，系统阐述各环节的技术要点及注意事项，以促进实验操作的标准化。

一、标本的采集与保存

1.1 标本类型与处理

ELISA技术可适用于多种生物标本的检测，包括血清、血浆、唾液、尿液及粪便等。其中，血清为最常用的检测样本。血清与血浆在ELISA中通常可互换使用，但需注意血浆中含有纤维蛋白原和抗凝剂，可能影响某些检测系统的性能。

血清样本采集后需静置至充分凝固，离心分离后取上清液。应严格避免溶血，因红细胞破裂释放的过氧化物酶活性物质可能在以辣根过氧化物酶（HRP）为标记的ELISA中引起非特异性显色。

1.2 标本保存与质量控制

新鲜采集的血清样本应尽快进行检测。如未能及时检测，需根据时间合理选择保存条件：

5日内检测者可存放于4℃；

需长期保存则应分装后冷冻于-20℃或更低温度，避免反复冻融导致抗体效价下降或蛋白变性。

样本中如有细菌污染，其内源性酶（如HRP）可能引起假阳性结果。因此，采集及保存过程中需注意无菌操作，必要时可加入适量防腐剂（如NaN₃，需注意其对某些酶活的抑制效应）。冷冻样本复温后应轻柔混匀，避免剧烈振荡产生气泡，确保样本均匀。混浊或沉淀样本需经离心或过滤澄清后再行检测。

二、试剂的准备与质量控制

2.1 试剂配制与保存

所有试剂应严格按照试剂盒说明书进行配制和使用。实验用水须为新鲜制备的高质量蒸馏水或去离子水。自配缓冲液需经pH计校准，保证离子强度及pH值的准确性。

试剂在使用前应从冰箱中取出，恢复至室温（尤其冬季），以减少温度对反应速率的影响。未使用的试剂应及时冷藏，避免多次冻融。

2.2 酶标板预处理

如使用非预包被板，需进行包被处理。包被浓度、时间及缓冲液体系需经优化确定。包被后的板条应密封防潮，避免保存过程中活性下降。

三、加样操作规范

3.1 加样步骤与技术要求

常规间接法或夹心法ELISA包括三次主要加样步骤：加入样本、酶标记物及底物溶液。加样时需注意：

加样位置应位于孔底中心，避免液滴附着于孔壁；

加样量须精确，使用校正后的微量移液器或定量加样器；

防止交叉污染，每加一样本需更换吸头。

某些检测需对样本进行预稀释。可在试管中稀释后加入反应孔，也可先加稀释液至板孔，再加入样本，并于微型振荡器上混匀1分钟，确保均匀分散。

3.2 加酶结合物与底物

酶标抗体及底物应用液建议使用多道加液器，以提高加样效率及一致性。底物溶液应避光保存，临用前配制，防止光解或氧化失效。

四、温育过程的控制

4.1 温育的原理与重要性

ELISA依赖于抗原与抗体在固相表面的特异性结合。由于反应仅发生于固-液界面，分子需通过扩散才能与固相上的结合位点接触，因此需充分的时间以达成结合平衡。后续的酶标抗体与已结合抗原的反应同样需扩散过程。

4.2 温育条件的选择

常用温育温度包括37℃、室温（20–25℃）及4℃。37℃为最常用条件，适合多数抗原抗体反应。建议温育时间通常为1–2小时。提高温度（如43℃）可加速反应，但过高温度可能导致蛋白变性。4℃结合虽更彻底，但因耗时过长（常需过夜），一般不用于常规ELISA流程。

4.3 温育操作要点

水浴温育：将反应板置水浴箱中，板底接触水面，加盖防止蒸发；

湿盒温育：置于预温的金属湿盒中，盒内铺湿纱布以保证湿度；

避免叠放：确保每块板受热均匀，温度迅速平衡；

时间控制：需严格按时操作，建议使用定时器，尤其同时操作多板时需合理安排顺序。

五、常见问题与优化策略

尽管ELISA技术成熟，实际操作中仍可能遇到诸如本底过高、重复性差或灵敏度不足等问题。除严格依规程操作外，还需注意：

洗涤彻底：避免残留未结合物导致非特异显色；

封闭充分：使用合适封闭液以减少非特异性吸附；

设备校准：定期校验移液器、酶标仪等设备。

结语

ELISA作为一种高灵敏度、特异性强的免疫分析技术，其结果的可靠性极大程度上依赖于操作的规范性与细节控制。建立标准化操作流程（SOP）、严格进行质量控制、合理处理与保存样本，以及优化温育与加样步骤，是确保ELISA检测准确的关键所在。随着技术发展，自动化ELISA系统也逐渐普及，但手工操作中的技术要点仍具有重要基础意义。

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