Hello,hello,各位小伙伴。转眼来到了11月份，气温骤降，大家在做科研的同时也要注意防寒保暖啊，接近年尾，各位的科研是否顺利呢？

今天为大家分享的文章是发表于《Nature Communications》的《Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors》。该研究针对空间转录组学技术快速发展但缺乏系统基准测试的现状，在统一实验条件下，对四种高通量亚细胞分辨率空间转录组学平台（Stereo-seq v1.3、Visium HD FFPE、CosMx 6K、Xenium 5K）进行了全面评估。研究采用结直肠癌、肝细胞癌、卵巢癌三种癌症的未治疗临床样本，通过 FFPE、新鲜冷冻、单细胞悬液等多种处理方式，结合 CODEX 蛋白图谱和 scRNA-seq 作为参考数据，从分子捕获效率、背景噪声控制、单细胞分割、细胞注释、空间聚类等多维度开展测试。

研究思路思维导图

下面我们来看一下文章中的具体结果：

一、分子捕获效率评估

1：标记基因检测灵敏度：上皮细胞标记基因 EPCAM 在所有平台均呈现清晰空间模式，与 H&E 染色和 PanCK 免疫染色一致；Xenium 5K 对 EPCAM、CD68、CD4 等多种标记基因的检测灵敏度最优（平均转录本计数更高）；在共享区域和 ROI（400×400μm）分析中，Visium HD FFPE 的癌症细胞标记基因检测优于 Stereo-seq v1.3，Xenium 5K 优于 CosMx 6K。

2：与 scRNA-seq 的相关性：Stereo-seq v1.3（R=0.85）、Visium HD FFPE（R=0.80）、Xenium 5K（R=0.82）与 scRNA-seq 的基因表达相关性高，而 CosMx 6K（R=0.53）比较大。

3：转录本 / 基因检出量：

单基因转录本计数：Stereo-seq v1.3、Visium HD FFPE、Xenium 5K 的基因表达变异性强，能有效检测不同表达水平基因；CosMx 6K 虽总转录本计数更高，但基因间变异性低，难以区分差异表达。

4：每 8μm bin 检出量：Visium HD FFPE 的转录本和基因检出量优于 Stereo-seq v1.3；Xenium 5K 在 HCC 中检出量高于 CosMx 6K，在 OV 中因癌症类型和基因面板差异略低，共享基因分析中 Xenium 5K 仍更优。

5：测序质量：Stereo-seq v1.3 的 UMI 质控通过率高，但无效空间条形码比例高（空间信息丢失多），且基因组间区域映射比例高；Visium HD FFPE 在相同测序深度下，人类转录本测序饱和度更低。

图1：跨ST平台的基因检测灵敏度评估

二：背景噪声与扩散控制评估

1.背景噪声控制：iST 平台中，CosMx 6K 的阴性探针（NegProbe）和阴性代码（NegCode）信号显著高于 Xenium 5K，且阴性信号的空间自相关性（Moran’s I）更强（聚集性高，背景干扰大）；归一化后，Xenium 5K 的阴性控制信号占比更低，在 OV 样本坏死区域的背景噪声尤为微弱；非特异性探针结合是 iST 平台背景噪声的主要来源（阴性探针信号 > 阴性代码）。

2.转录本扩散控制：sST 平台中，Stereo-seq v1.3 和 Visium HD FFPE 均存在组织边界外的转录本扩散，但 Visium HD FFPE 的扩散距离更短、组织外转录本丰度更低；归一化后（组织外 / 组织内转录本计数比），Stereo-seq v1.3 的扩散程度显著高于 Visium HD FFPE。

图2：背景噪声与扩散控制评估

三、转录本定位准确性评估

1.局部空间一致性：在 COAD 的三级淋巴样结构（TLS）区域，Visium HD FFPE 和 Xenium 5K 的 B 细胞（MS4A1）、CD4+T 细胞（CD4）、CD8+T 细胞（CD8A）标记基因空间分布与 CODEX 蛋白染色（CD20、CD4、CD8）高度吻合；在 HCC 血管区域，Xenium 5K 的 CD34（内皮细胞标记）转录本沿血管边缘富集，与解剖结构一致；在 OV 巨噬细胞富集区域，所有平台均能检测到 CD68 表达。

2：全局一致性：基于 CODEX 注释的细胞类型，Visium HD FFPE（sST 中）和 Xenium 5K（iST 中）与 CODEX 的空间模式相关性更高；上皮细胞（COAD/OV 中高丰度）的平台间差异较小，免疫细胞和基质细胞的差异更显著。

3：特征基因集一致性：利用 scRNA-seq 鉴定的细胞类型差异表达基因构建特征集，其空间一致性优于单个标记基因；Visium HD FFPE 和 Xenium 5K 的特征集与 CODEX 的相关性仍为最优。

 图3：转录本与蛋白质相关性的评估

四、单细胞分割评估

1.分割形态学差异：CosMx 6K 和 Xenium 5K 基于核 / 膜 / 细胞质多通道染色进行分割，Stereo-seq v1.3 通过核掩码扩展 5μm 估算细胞边界（Visium HD FFPE 无官方分割算法）；CosMx 6K 分割的细胞更大、凸度（solidity）和圆度更高（形态更规则），Xenium 5K 能有效捕获肝细胞等不规则形态细胞。

2.分割准确性：以 72,405 个手动标注核边界为金标准，Xenium 5K 和 CosMx 6K 的自动分割细胞数量与手动计数匹配度高（偏差小）；Stereo-seq v1.3 因染色伪影，常将非细胞结构误判为细胞，分割数量偏差大（自动计数 > 手动计数）。

3.转录本分配效率：Xenium 5K 和 CosMx 6K 能将更高比例的转录本保留在细胞边界内；在共享基因集中，iST 平台（Xenium 5K/CosMx 6K）的单细胞转录本 / 基因计数与 scRNA-seq 相当；Xenium 5K 的核分割结果中，基因和转录本计数更高。

4.人工共表达控制：ST 数据中 EPCAM（上皮）与 CD3E/CD68（免疫）的共表达水平高于 scRNA-seq；Xenium 5K 分割后，36 对互斥谱系标记基因的共表达相关性最低（分离效果最优），Stereo-seq v1.3 最差。

其中CosMx 6K分割细胞形态更规则（更大、凸度和圆度更高），转录本保留在细胞边界内的比例高，与 Xenium 5K 同为 iST 平台，在单细胞转录本分配效率上远超 sST 平台。

图4：细胞分割的比较

五、细胞聚类与注释评估

1．聚类效果：scRNA-seq 的聚类分离度（平均轮廓宽度 ASW）最高；ST 平台中，iST 平台（Xenium 5K/CosMx 6K）因亚细胞分辨率，聚类分离度优于 sST 平台（Stereo-seq v1.3/Visium HD FFPE），能更清晰区分细胞亚型。

2.细胞类型注释可靠性：

注释一致性：Xenium 5K 在 5 种注释工具（SELINA/Celltypist 等）中的细胞类型注释一致性最高（多工具标注相同类型的细胞比例高），熵值低（注释稳定性强）；CosMx 6K 能恢复更多细胞类型。

与 scRNA-seq 匹配度：Xenium 5K 的标记基因（CD34/COL5A2/CD68 等）表达模式与 scRNA-seq 最吻合；Stereo-seq v1.3 在 COAD/OV 中与 scRNA-seq 一致性高，Xenium 5K 在 HCC/OV 中最优。

亚型注释：Xenium 5K 和 CosMx 6K 能恢复更多 T 细胞亚型. 在结直肠癌的三级淋巴样结构中，CosMx 6K 能同时捕获 B 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞及血浆细胞等多种免疫亚型，为免疫微环境的复杂网络分析提供了完整数据。

3.多通道染色优势：Xenium 5K 的核 / 膜 / 细胞质多通道染色能准确捕获肝细胞等不规则形态，提升转录本分配准确性，还能识别多核细胞（中性粒细胞、肝细胞），而核仅分割方法难以实现。

图5：细胞聚类、细胞类型注释以及与相邻CODEX的空间对齐的比较分析

六、空间聚类与通路富集评估

1.空间聚类一致性：使用 CellCharter 进行空间聚类，除 HCC 中的 Stereo-seq v1.3 外，其余平台与 CODEX 的聚类比例相关性均较高（大尺度组织架构还原效果好）；所有平台均能识别肿瘤核心与边界区域的恶性细胞分布，Visium HD FFPE 和 Xenium 5K 能勾勒更连续的肿瘤边界；Xenium 5K 还能区分肿瘤浸润型与外周型 CD8+T 细胞。

2.差异基因与通路富集：

差异表达基因（DEG）：Xenium 5K 在免疫浸润区 vs 肿瘤区、肿瘤区 vs 正常上皮区的 DEG 数量和比例最高，CosMx 6K 最少；平台间 DEG 存在重叠，但平台特异性 DEG 较多（反映检测灵敏度差异）。

通路富集：Xenium 5K 在免疫浸润区优先富集 T 细胞激活、白细胞细胞毒性等免疫相关通路，在肿瘤区富集细胞分裂 / 增殖通路；Visium HD FFPE 肿瘤区富集类似增殖通路，但免疫区通路偏向细胞外基质组织；CosMx 6K 肿瘤区富集代谢相关通路。

图6：空间聚类与恶性细胞分布的比较

综合以上，我们可以看到CosMx 6K具有总捕获量高；样本兼容性高；单细胞分割形态规则，转录本分配准，多核细胞可识别；亚型覆盖细胞类型 / 亚型捕获全，稀有亚型可检出；空间架构区域边界清晰等核心优势，契合具有以下需求的研究人员：

1、聚焦细胞亚型广谱捕获（如免疫细胞细分亚群），需完整呈现细胞类型多样性的研究

2、利用临床FFPE 存档样本，开展肿瘤微环境、疾病进展相关的转化医学研究

3、需快速获得大量转录本数据，进行初步筛查后再深入分析的研究（如药物靶点初步筛选）

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