一、网络药理学的核心作用

1、预测药物潜在作用靶点与分子机制（如中药复方的协同作用解析）；

2、揭示疾病发生发展的核心通路网络，发现新的治疗靶点；

3、指导药物组合筛选、老药新用及副作用预测；

4、为基础实验（如细胞、动物实验）提供明确的验证方向，减少盲目性。

二、多因子检测在网络药理学中的关键助力

1、靶点 / 通路验证：同步检测关键信号通路中多个蛋白因子（如细胞因子、炎症因子、激酶、受体等）的表达水平，验证网络药理学预测的靶点或通路是否真实激活 / 抑制；

2、疾病分型与机制解析：量化疾病模型与正常组的多因子差异表达谱，为网络药理学构建 “疾病 - 靶点 - 因子” 关联网络提供实验数据支撑；

3、药物疗效评价：检测药物干预后，多靶点相关因子的表达变化，验证药物是否通过预测通路发挥作用（如抗炎、抗肿瘤、免疫调节等）；

4、协同作用验证：针对复方药物或联合治疗方案，通过多因子同步检测，揭示不同成分 / 药物在调控网络中的协同或拮抗效应；

5、生物标志物筛选：结合网络药理学预测的核心节点，通过多因子检测发现具有诊断或预后价值的潜在生物标志物（如肿瘤微环境中的细胞因子组合）。

导读

肝癌（HCC）位列全球癌症死亡率第三，预后欠佳，亟需有效治疗手段。Small 期刊（IF:11.459）2020 年 1 月发表的 “人参皂苷 Rg3 纳米颗粒偶联物抑制 HCC 的发生和转移” 一文，通过 Fe@Fe3O4 纳米颗粒与人参皂苷 Rg3 偶联制备出高适配性纳米药物 NpRg3，该药物可改善体内肠道菌群与代谢失衡，进而抑制 HCC 进展及转移，为肿瘤治疗提供了全新策略。

 

论文 ID

题目：Nanoparticle Conjugation of Ginsenoside Rg3 Inhibits Hepatocellular Carcinoma Development and Metastasis译名：人参皂苷 Rg3 纳米颗粒偶联物抑制 HCC 的发生和转移期刊：SmallIF：11.459发表时间：2020.1，DOI 号：10.1002/smll.201905233

 

主要内容

1、人参皂苷 Rg3 纳米颗粒的偶联和表征

为增强人参皂苷 Rg3 的抗肿瘤活性，本研究对其结构进行优化并合成 NpRg3：通过程序微流控工艺制备 Fe@Fe3O4 纳米粒子，借助自主开发的偶联流程实现两者结合，并明确了 NpRg3 的分子结构（图 1a）。透射电子显微镜观察显示，Fe@Fe3O4（I 和 II）与 NpRg3（III 和 IV）均呈核壳结构，且 NpRg3 的有机偶联特征显著，颗粒间距更短（图 1b）。傅里叶变换红外光谱分析证实 NpRg3 含大量 - OH 基团及 CH2/CH 基团（对应纳米粒子与人参皂苷 Rg3 的表面 - OH），且相比 Fe@Fe3O4，NpRg3 出现 2 个人参皂苷 Rg3 特有的双吸收峰（图 1c）。此外，研究还检测了两者的流体动力尺寸、Zeta 电位及稳定性：NpRg3 因氨基存在，Zeta 电位显著高于 Fe@Fe3O4，稳定性更优；合成过程中经 2 次干燥以去除杂质、校准产物，受干燥团聚及磁吸引影响，干燥状态下两者的流体动力尺寸均大于分散状态，且 NpRg3 因偶联作用，流体动力尺寸大于 Fe@Fe3O4（图 1d-f）。通过检测不同质量比反应后溶液中残留的人参皂苷 Rg3，确定最佳偶联比例为 1：1（图 1g），高效液相色谱进一步验证，人参皂苷 Rg3 与 NpRg3 均在约 12 min 达到基线分离（图 1h）。生理条件下，人参皂苷 Rg3 从复合物中的释放量随时间推移逐步上升。

 

2、人参皂苷 Rg3 纳米偶联物可延长原位 HCC 小鼠的存活周期

研究采用二甲基亚硝胺（DEN）诱导 2 周龄小鼠构建原位 HCC 模型（图 2a），结果显示 DEN 诱导的 HCC 呈动态进展趋势：小鼠注射 DEN 后第 28 周出现 HCC 病灶，随后持续增殖并侵袭远端器官，这一结论已通过肝脏组织病理学检查证实（图 2b）。实验将 HCC 小鼠随机分为对照组、纳米粒子组、Rg3 组及 NpRg3 组（每组 n=5），其中 15 只 / 组随访观察存活情况至 70 周，剩余 10 只 / 组于 42 周时处死以评估 HCC 进展。数据表明，与其他三组相比，NpRg3 处理组能显著延长原位 HCC 小鼠的存活时间（图 2c）。

 

3、人参皂苷 Rg3 纳米偶联物可抑制原位 HCC 小鼠的 HCC 进展

小鼠注射 DEN 第 42 周后，对照组与纳米粒子组出现明显的多发性肿瘤结节，人参皂苷 Rg3 组肿瘤结节略有减少，而 NpRg3 组几乎未观察到肿瘤结节（图 3a）。与其余三组相比，NpRg3 组的肝脏 / 体重比值显著降低，肝脏表面肿瘤数量明显减少，且表面最大肿瘤直径也显著缩小。这表明，人参皂苷 Rg3 与纳米颗粒结合后，对 HCC 形成及进展的抑制效果，显著优于单独使用纳米粒子或人参皂苷 Rg3。相较于对照组和纳米粒子组，人参皂苷 Rg3 组的血清丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶水平有所下降；而 NpRg3 组这两项指标显著降低（接近基线水平），HCC 小鼠的肝功能得到有效改善（图 3c）。肝脏组织病理学检测显示，对照组与纳米粒子组中 50%-90% 的肝脏存在肿瘤增生，增生细胞的形态及分布符合 HCC 组织病理学特征；人参皂苷 Rg3 组肝脏肿瘤增生面积有所减小，NpRg3 组则罕见肿瘤结节，肿瘤增生面积显著缩减（图 3d）。

    

4、人参皂苷 Rg3 纳米偶联物可降低 HCC 肺转移风险

通过透射电子显微镜观察肿瘤细胞超微结构：对照组与纳米粒子组的肿瘤细胞存在异常分裂现象，且含有大量完整线粒体，提示肿瘤处于活跃增殖状态；而 NpRg3 组肿瘤细胞呈现单细胞核特征，线粒体数量显著减少（图 4a）。酸滴定实验显示 NpRg3 的 pH 值为 9.15，具备较强碱性，推测其可中和 HCC 肿瘤缺氧引发的酸性微环境，改变肿瘤增殖所需的最佳酸碱条件。肺转移是 HCC 患者常见致死原因：宏观观察可见，对照组与纳米粒子组肺组织中存在多个转移结节，NpRg3 组则未发现肺转移结节（图 4b）；数据显示，NpRg3 组 HCC 肺转移比例较对照组和纳米粒子组显著降低（图 4c）。肺组织病理学检查证实，对照组与纳米粒子组的肺结节为血管丰富的 HCC 转移灶，而 NpRg3 组无此类结节（图 4d）。肿瘤血管生成与循环肿瘤细胞是 HCC 转移的关键影响因素：人参皂苷 Rg3 可抑制内皮祖细胞从骨髓微环境向循环系统迁移，并调控 VEGF 依赖的肿瘤血管生成；NpRg3 离开肝脏后，铁基成分的长期循环可能激活血液免疫细胞，对循环肿瘤细胞发挥杀伤作用。以上结果表明，NpRg3 不仅能抑制肝脏原发性 HCC，还可有效阻断 HCC 向肺的转移。

 

5、人参皂苷 Rg3 纳米偶联物可抑制回盲肠形态及肠道微生物改变

肝脏功能与状态通过肝肠循环及肠道微生物 - 肝脏轴，与肠道功能、肠道微生物密切相关，因此本研究观察了回盲肠形态及肠道微生物群的变化情况。与对照组和纳米粒子组相比，NpRg3 处理的 HCC 小鼠，其体内回盲肠结构发生明显改变，盲肠长度显著缩短（图 5a）。研究收集正常对照组、DEN 注射后 30 周（30W）组及 42 周（42W）组的回盲肠样本，分析细菌组成：韦恩图结果显示，四组共存在 433 个 OTUs，其中 4 个 OTUs 为 NpRg3 组特有（图 5b）。非度量多维尺度分析显示，随着 HCC 进展，肠道微生物群从正常对照组到 DEN-30W 组、再到 DEN-42W 组呈现规律性变化；而 NpRg3 组肠道微生物群形成独特聚类，与 DEN-42W 组距离较远（图 5c），表明 NpRg3 能显著延缓肠道微生物改变，效果甚至优于 DEN-30W 组。主成分分析计算 β 多样性以评估微生物群相似性，结果显示正常对照组与 NpRg3 组的肠道微生物群落聚集在一起，而 Den-30W 组与 Den-42W 组的微生物群落聚类成团（图 5d）。主坐标分析进一步揭示微生物群落差异，证实 NpRg3 可诱导形成独特的肠道微生物结构，与 DEN-30W 组、DEN-42W 组实现显著区分（图 5e）。

 

6、参与 NpRg3 抗肿瘤作用的关键细菌及微生物基因功能

通过分析微生物的分类组成与变化特征，本研究鉴定出参与 NpRg3 抗肿瘤功能的关键细菌群落：拟杆菌门、硬壁菌门和蛋白菌门为四组样本中的优势菌门。与 DEN-30W 组相比，DEN-42W 组拟杆菌门与疣微菌门的丰度有所下降，而 NpRg3 给药后这两类菌门的丰度显著提升；反之，DEN-42W 组硬壁菌门丰度较 DEN-30W 组升高，NpRg3 处理后则明显降低（图 6a）。细菌属水平分析显示，毛螺菌属与立克次体属的丰度在 DEN-30W 组和 DEN-42W 组中呈上升趋势，NpRg3 给药后则显著下降（图 6b）；另有 15 个细菌属在 DEN-42W 组的丰度较 DEN-30W 组减少，而 NpRg3 处理后其丰度得到恢复性增加（图 6c）。肠道微生物的系统发育与基因功能密切相关，基于群落系统发育调查的代谢功能分析表明：与 DEN-42W 组相比，NpRg3 组共有 29 种微生物功能显著富集，包括核黄素生物合成、氧戊二酸铁氧还蛋白氧化还原酶、戊糖磷酸途径等；同时，肽镍转运系统、多糖转运系统等 7 种微生物功能的丰度明显降低（图 6d）。

7、NpRg3 通过强化免疫应答抑制 HCC 进展

本研究采用 Luminex 多重技术检测肝脏组织中的细胞因子与趋化因子，共检测出 29 种炎症因子，并筛选出具有显著差异的炎症标志物。结果显示：与 DEN-30W 组相比，DEN-42W 组中 TNF-α、IFN-γ、IL-1β 等可杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤进展的炎症因子显著下调，而 NpRg3 给药后这些因子水平明显回升；反之，DEN-42W 组中 KC、LIX 等促肿瘤趋化因子较 DEN-30W 组升高，NpRg3 处理后则降低。可见 NpRg3 通过上调抑瘤炎症因子、下调促瘤趋化因子，显著抑制 HCC 进展。

   

8、NpRg3 调控 HCC 小鼠关键代谢物变化

为明确宿主代谢与 NpRg3 抗肿瘤作用的关联，研究对小鼠血清及肝脏开展代谢组学分析，质控结果显示内标稳定、数据可靠。代谢组学轮廓呈现规律变化：从正常对照组、DEN-30W 组到 DEN-42W 组呈渐进式改变，NpRg3 组则呈反向趋势（图 7a）。血清中 69 种代谢物与 HCC 进展相关，DEN-42W 组 3 - 吲哚丙酸、尿素水平较 DEN-30W 组升高，NpRg3 组则降低（图 7b）；肝脏中 110 种代谢物与 HCC 进展相关，NpRg3 组游离脂肪酸 18_2、16_2 较 DEN-42W 组增加，N8 - 乙酰亚精氨酸、肌酐则降低（图 7c）。

 

9、NpRg3 重塑 HCC 小鼠肠道菌群与代谢的特异性关联网络

肠 - 肝轴在 HCC 发生发展中发挥关键作用：肠道微生物可调控宿主代谢功能及能量平衡，其紊乱可能诱发代谢性疾病，因此 HCC 进展中肠道菌群的改变会推动宿主代谢及关键代谢物的变化。本研究基于同一小鼠个体的肠道菌群与关键代谢物，构建各组关联网络（相关系数＞0.70 界定为明确关联），并筛选 DEN-42W 组与 NpRg3 组间存在显著差异的菌属及代谢物进行分析。血清代谢物与肠道菌群的相关性分析显示：对照组有 300 组交互关联存在统计学差异，NpRg3 组则为 188 组。NpRg3 组中丁酸产生菌 Butyricicoccus（有益菌）显著富集，其与 3 - 羟基异戊酸呈负相关、与乳酸菌呈正相关；抗炎有益菌 Akkermansia 同样富集，对照组中其与 IV 型梭状芽胞杆菌呈正相关，而 NpRg3 组中与双歧杆菌呈正相关、与梭状芽胞杆菌 XlVb 及毛螺菌呈负相关（图 8），提示 NpRg3 可重建 HCC 小鼠肠道菌群与血清代谢的特异性关联网络。肝组织代谢物与肠道菌群的关联分析显示：对照组有 362 组交互关联存在统计学差异，NpRg3 组为 326 组。对照组中 Akkermansia 与乳酸菌、3 - 氨基水杨酸及梭状芽胞杆菌 IV 呈正相关，NpRg3 组中则与梭状芽胞杆菌 XlVb 及 2 - 羟基丁酸呈负相关（图 8）。上述结果表明，NpRg3 可重塑肠道菌群与肝组织代谢的特异性关联网络，且多数关联趋势与血清水平一致。

总结

研究通过将 Fe@Fe₃O₄纳米颗粒与人参皂苷 Rg3 偶联，成功研发出新型纳米药物 NpRg3。实验证实，该偶联物可显著延长 DEN 诱导的 HCC 小鼠生存期，不仅能强效抑制 HCC 原发灶进展，还可完全阻断其向肺转移。在疾病进程调控方面，NpRg3 能将 HCC 小鼠回盲肠形态及肠道菌群的异常改变延迟超 12 周；菌群及基因功能层面，NpRg3 可上调拟杆菌门、疣微菌门丰度并下调硬壁菌门丰度，同时调控 36 种预测微生物基因功能（29 种富集、7 种下调）。代谢组学分析显示，HCC 进展中代谢组呈规律性异常，而 NpRg3 可逆转该肿瘤主导的代谢紊乱：降低血清 3 - 吲哚丙酸、尿素浓度，升高肝组织游离脂肪酸 18_2、16_2 水平并降低 N8 - 乙酰亚精氨酸、肌酐含量，提示这些代谢物为 HCC 关键治疗靶点。尤为重要的是，NpRg3 可重塑 HCC 小鼠肠道菌群与代谢间失衡的关联网络。综上，研究充分彰显了人参皂苷 Rg3 纳米偶联物的体内抗肿瘤潜力。

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