一、技术原理概述

酶联免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）是一种将抗原-抗体特异性识别与酶促高效催化相结合的高灵敏度免疫分析技术。其核心原理在于：首先将已知的抗原或抗体固定于固相载体表面，形成固相免疫吸附剂；加入待测样本后，其中的目标分析物可与固相上的对应配体发生特异性结合；随后通过酶标记的检测抗体或抗原形成免疫复合物；经彻底洗涤去除游离成分后，加入酶特异性底物进行显色反应；最终通过测定吸光度值实现对目标物的定性与定量分析。该方法凭借其优异的特异性和灵敏度，检测下限可达皮摩尔（pmol）级别。

二、基本检测模式

ELISA作为一种通用型免疫测定平台，同时适用于抗原与抗体的检测。其标准化操作流程主要包含四个关键环节：

1.固相包被： 将具有免疫活性的已知抗体或抗原通过物理吸附或共价交联方式固定于固相载体（如聚苯乙烯微孔板）表面。

2.特异性反应： 根据实验设计（直接法、间接法、夹心法等），使待测样本与酶标记物按序与固相上的捕获分子发生特异性免疫结合。

3.洗涤分离： 通过严格的洗涤步骤，彻底移除未结合的游离组分，确保仅保留固相表面形成的特异性抗原-抗体复合物。

4.信号检测： 加入酶特异性底物溶液，通过酶催化反应生成有色产物，测定吸光度值以实现目标分析物的定量或定性检测。

三、主要方法学分类

根据检测原理与操作设计的差异，ELISA主要可分为以下几种经典方法：

1. 直接法

原理： 将抗原包被于固相载体，直接加入酶标记的一抗进行检测。

特点： 操作简便快速，避免二抗交叉反应；但需为每种抗原制备特异性的酶标一抗，通用性低，灵敏度相对有限。适用于小分子抗原检测。

2. 间接法

原理： 将抗原包被于固相，先后与待测抗体及酶标二抗反应，形成“固相抗原-待测抗体-酶标二抗”复合物。

特点： 通过通用二抗实现信号放大与多指标检测，灵活性高；但存在交叉反应可能，步骤较多。主要用于抗体检测。

3. 夹心法

原理： 使用配对抗体，以捕获抗体固定抗原后，通过直接或间接方式用检测抗体进行检测。可分为双抗体夹心法（检测抗原）与双抗原夹心法（检测抗体）。

特点： 灵敏度与特异性高，对样本纯度要求低；但需验证配对抗体，且要求抗原具备至少两个结合表位，不适用于小分子单价抗原。

4. 竞争法

原理： 待测抗原与酶标抗原竞争结合固相上的有限抗体位点，通过检测信号抑制程度定量分析物。

特点： 适用于小分子抗原（如激素、药物）检测，对样本纯度要求低，操作简便；但对大分子抗原检测灵敏度较低，特异性相对较差。

四、应用领域

基于其高灵敏度、高特异性及高通量特点，ELISA技术在以下领域具有广泛应用：

1. 临床医学诊断

  感染性疾病病原体抗原/抗体检测

  特种蛋白定量（免疫球蛋白、细胞因子、肿瘤标志物等）

  激素水平测定

  治疗药物监测与血药浓度评估

2. 食品安全监测

  食品及农产品中重金属污染检测

  农药残留分析

  生物毒素（霉菌毒素、海洋毒素等）筛查

3. 畜牧兽医与动物检疫

  饲料中有毒有害物质（农药、霉菌毒素）残留监控

  畜禽产品兽药残留检测

  动物疫病诊断与疫情监测

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