一、技术原理与核心价值

  噬菌体展示技术是一种基于基因融合与亲和筛选的平台技术。其基本原理是将编码目标多肽或蛋白质的DNA序列，插入并融合到编码噬菌体特定外壳蛋白的基因序列中。经宿主细胞表达与组装后，外源分子便能随子代噬菌体的产生而展示在其表面。随后，通过“生物淘洗”过程——即利用固定化的靶标分子（如抗原、受体）进行多轮结合、洗涤、洗脱与再扩增——可高效地从复杂文库中特异性富集出携带相应结合特性的噬菌体克隆。

  该技术的核心优势在于实现了基因型（包裹在内的噬菌体DNA）与表型（展示于表面的蛋白）的物理连接。这种直接关联性使得高通量筛选、分子定向进化以及对蛋白质相互作用进行大规模平行分析成为可能，极大地加速了功能分子的发现与优化进程。

二、噬菌体的基本特性与分类

  噬菌体是一类专性感染细菌、放线菌、真菌及部分单细胞藻类等微生物的病毒。根据感染宿主后的不同增殖策略与生物学结局，噬菌体主要可分为烈性噬菌体与温和噬菌体两大类。

  烈性噬菌体在感染宿主细胞后，通常迅速完成吸附、侵入、基因组复制与表达、子代颗粒装配以及宿主细胞裂解等连续过程，最终导致宿主死亡并释放大量子代噬菌体。此过程实现了噬菌体的增殖，亦常被称为裂解周期。常见的烈性噬菌体包括T4噬菌体、T7噬菌体和λ噬菌体（部分情况下亦可进入温和周期）等。

  相比之下，温和噬菌体感染宿主后，其基因组可选择性地整合至宿主染色体中，以前噬菌体形式存在，并随宿主基因组复制而同步复制。在此状态下，噬菌体通常不进行自主复制与裂解宿主，此即溶原周期。整合的前噬菌体可在特定条件下被诱导进入裂解周期。常见的温和噬菌体代表为M13、fd等丝状噬菌体。

  这两类噬菌体因其独特的生活周期与遗传特性，在基础病毒学研究、分子生物学工具开发以及细菌遗传与进化等领域具有重要价值。

图 1 噬菌体的两种生命周期：裂解性和溶原性

三、主要噬菌体展示系统

根据所采用的噬菌体载体特性，目前已发展出多个成熟的展示系统，各有其适用范围。

1、丝状噬菌体展示系统：以M13为代表，是最经典和应用最广泛的系统。其为单链DNA温和噬菌体，通过非裂解方式分泌释放，利于保持宿主活性。主要利用衣壳蛋白pIII（低拷贝数，适于展示大分子）和pVIII（高拷贝数，适于多价展示短肽）进行融合展示，但对插入片段大小较为敏感，尤其是pVIII系统。

2、T4噬菌体展示系统：基于烈性噬菌体T4，其具有二十面体头部结构。系统利用非必需的外壳蛋白SOC和HOC作为融合位点，在细胞内装配，无需分泌过程，因此对外源蛋白大小和性质限制较小。高拷贝数的特性支持多价展示，有利于低亲和力相互作用的筛选。

3、T7噬菌体展示系统：采用烈性噬菌体T7，通过裂解释放。主要融合位点为衣壳蛋白10B。由于装配和释放均在胞内完成，可展示的序列范围广，灵活性高，既能高拷贝展示短肽，也能以中低拷贝展示大蛋白片段。

4、λ噬菌体展示系统：基于可裂解亦可溶原的λ噬菌体。展示位点包括头部装饰蛋白D和尾部管状蛋白PV。与T4、T7类似，其在胞内装配，可展示复杂或较大的蛋白质，并提供不同的价态选择。

选择何种系统需综合考虑目标蛋白特性、所需展示价态、筛选策略及后续应用需求。

四、技术流程：建库与筛选

一套完整的噬菌体展示实验流程主要包括文库构建和筛选富集两大阶段。

1、文库构建：目标是创建高多样性、高质量的展示分子集合。常见的文库类型包括：

👉单链抗体片段库：通过连接肽将抗体重链和轻链可变区连接成单链。

👉抗原结合片段库：包含完整的Fab段（重链VH-CH1与轻链VL-CL），通过二硫键稳定。

👉重链抗体可变区库：仅包含单一结构域的重链可变区，分子量小，稳定性好。

👉随机肽库：由合成随机序列构建，用于表位筛选或配体发现。

👉免疫库：来自免疫个体，富含针对特定抗原的高亲和力克隆。

👉天然库：来自非免疫个体，库容要求高，可获得完全人源化的抗体，但初始亲和力可能较低。

构建方法包括cDNA法、人工合成法和DNA酶切随机片段法等。通用流程涉及基因片段获取、PCR扩增、克隆至噬菌体展示载体、电转化宿主菌以及辅助病毒拯救以产生初级展示文库。

图2 噬菌体抗体库构建流程

2、筛选与富集：这是一个迭代过程，旨在从文库中分离出特异性结合克隆。

✔️结合：将噬菌体展示文库与固定于固相（如酶标板、磁珠）的靶标分子孵育。

✔️洗涤：去除未结合及非特异性结合的噬菌体。

✔️洗脱：通过改变pH、使用竞争性配体或蛋白酶切等方式，回收特异性结合的噬菌体。

✔️扩增：将洗脱的噬菌体感染新鲜宿主菌进行扩增，以获得用于下一轮筛选的次级文库。

✔️重复：通常进行3-5轮上述“结合-洗涤-洗脱-扩增”循环，使目标克隆得到指数级富集。

✔️鉴定：对最终富集的克隆进行单克隆分离、DNA测序及表达验证，以确定其结合特异性和亲和力。

图 5  噬菌体文库的筛选

五、应用与未来展望

噬菌体展示技术已在生物医学的多个领域产生深远影响：

👍治疗性抗体与蛋白药物开发：是发现和优化全人源抗体、双特异性抗体及其他蛋白类药物的主要技术之一，已有多个基于该技术开发的药物获批上市，用于治疗癌症、自身免疫病等。

👍疫苗设计与抗原表位鉴定：可用于筛选病原体的中和表位或免疫优势表位，为疫苗设计提供依据。

👍诊断工具开发：筛选针对疾病标志物的高亲和力、高特异性结合分子，用于开发免疫检测试剂。

👍蛋白质相互作用研究：用于绘制蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸等的相互作用网络。

展望未来，该技术正与其他前沿领域深度融合，拓展出新的方向：

👍靶向递送与纳米医学：将展示特定靶向肽的噬菌体或其衍生颗粒作为载体，用于药物、基因或成像探针的精准递送。

👍材料科学与生物纳米技术：利用噬菌体可编程的自组装特性及展示的特定肽段，指导功能纳米材料（如电池电极材料、光电材料、生物传感器）的合成与组装。

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