一、蛋白质定量分析中的BCA法概述

   BCA法（二喹啉甲酸法）是一种广泛应用于溶液内蛋白质含量测定的分析技术。该方法基于特定的物理与化学反应，通过显色体系对蛋白质浓度进行定量评估，具有较高的准确性与重复性，已成为生物化学及分子生物学研究中常用的蛋白质定量手段。

   在生物体系统中，蛋白质不仅是细胞与组织结构的基本组成成分，也参与并调控各类生理生化过程。因此，对样本中蛋白质含量进行精确测定，是相关实验研究的重要基础。正常生理状态下，人体血液中蛋白质的浓度范围通常维持在60至80克/升之间。

   相较于其他定量方法，BCA法在操作上较为简便，且具备良好的灵敏度和线性范围，适用于多种样本类型的蛋白质含量测定。其原理主要依赖于碱性环境下蛋白质分子与二价铜离子的相互作用，以及随后与BCA试剂的显色反应，通过比色分析即可实现蛋白质浓度的可靠测定。因此，该方法在基础研究与实验分析中常作为首选的定量策略之一。

二、BCA法测定蛋白质含量的基本原理

   BCA法的定量基础在于二喹啉甲酸（BCA）这一稳定且具碱性的水溶性化合物。其作用机理主要包含两个连续发生的化学反应步骤。首先，在碱性介质中，蛋白质分子将试剂体系中的二价铜离子（Cu²⁺）还原为一价铜离子（Cu⁺）。随后，生成的一价铜离子与BCA分子发生特异性螯合，形成一种呈现蓝紫色的复合物。

   该复合物在562纳米波长处具有特征性吸收峰，其吸光度值与反应体系中蛋白质的浓度呈正相关。因此，通过测定反应液在562纳米处的吸光度，并参照已知浓度的标准蛋白质所建立的标准曲线，即可实现对样品中蛋白质含量的准确定量。

   此方法因检测灵敏度高、操作流程简便以及对多种常见干扰物（如缓冲液中的某些成分）耐受性较好等优点，在生物化学研究中应用广泛。需要注意的是，反应体系的孵育温度与时间等因素会对显色强度产生影响，因此优化并严格控制反应条件，是确保测定结果准确性与重复性的关键。

三、BCA法测定蛋白质含量的试剂配制

(一) BCA工作液的配制

本实验所需BCA工作液由试剂A与试剂B按比例混合而成，具体配制方法如下。

① 试剂A（1升）：
分别准确称取10克BCA（1%，w/v）、20克Na₂CO₃·H₂O（2%，w/v）、1.6克Na₂C₄H₄O₆·2H₂O（0.16%，w/v）、4克NaOH（0.4%，w/v）及9.5克NaHCO₃（0.95%，w/v）。将上述试剂依次溶解于适量蒸馏水中，完全溶解后定容至1升。使用NaOH溶液或固体NaHCO₃将溶液pH值精确调节至11.25。

② 试剂B（50毫升）：
准确称取2克CuSO₄·5H₂O（4%，w/v），加入蒸馏水溶解并定容至50毫升。

③ BCA工作液：
取50体积试剂A与1体积试剂B充分混合均匀，即为所需工作液。该混合试剂在适宜条件下可保持稳定约一周。

(二) 标准蛋白质溶液的配制

准确称取0.5克牛血清白蛋白（BSA），以蒸馏水溶解，并转移至100毫升容量瓶中定容，配制成浓度为5毫克/毫升的储备液。使用前，用蒸馏水或相应缓冲液将此储备液稀释10倍，获得浓度为0.5毫克/毫升的标准工作液，用于标准曲线的绘制。

四、BCA法测定蛋白质含量的操作步骤

 1. 加样准备
取96孔酶标板，按预先设计的实验布局，依次向各孔中加入标准品及待测样品。

 2. 显色反应
于每孔中准确加入20微升样品溶液，随即加入200微升预先配制的BCA工作液。轻轻振荡酶标板以确保反应液充分混匀。将酶标板置于37℃恒温箱中孵育30至60分钟，待反应完全后取出，冷却至室温。

 3. 吸光度测定
使用酶标仪，选择562纳米作为测定波长，以未加入蛋白质样品的BCA工作液孔作为空白对照，读取各孔的吸光度值。以系列浓度牛血清白蛋白（BSA）标准溶液的浓度为横坐标，对应测得的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

 4. 浓度计算
根据待测样品孔测得的吸光度值，在标准曲线上查得对应的蛋白质浓度。若吸光度值落在标准曲线线性范围之外，可适当稀释样品后重新测定，以确保结果准确性。最终计算结果可表示为克每升（g/L）或根据需要进行单位换算。

五、标准曲线绘制与浓度计算

 1、数据收集
分别测定系列浓度牛血清白蛋白（BSA）标准溶液（通常建议设置不少于6个浓度梯度）及待测样品的吸光度值。

 2、散点图绘制
将标准溶液的已知浓度（x轴）与对应的平均吸光度值（y轴）录入数据分析软件，生成XY散点图。

 3、标准曲线拟合
对散点图数据进行线性回归分析，添加趋势线并显示其线性方程及决定系数（R²值）。R²值用于评估数据点与拟合直线的接近程度，其值越接近1（通常要求≥0.99），表明线性关系越好，定量结果的可靠性越高。

 4、样品浓度计算
将待测样品的吸光度值代入上述线性回归方程，计算得出对应的蛋白质浓度。若样品经稀释处理，需在最终结果中乘以相应的稀释倍数。

六、蛋白质浓度测定实验的注意事项

为保障BCA法测定蛋白质浓度的准确性、重复性及可靠性，实验操作中需注意以下要点：

 1、标准品的配制与保存
标准品储备液可于-20℃条件下长期保存（建议不超过一年）。但每次实验时，必须使用新鲜配制的标准工作液绘制标准曲线，以避免因储存条件导致的标准品活性变化对定量结果产生影响。

 2、实验重复与数据处理
建议每个样品设置不少于三个技术重复，以评估实验的重复性。后续数据处理时，可依据统计学方法（如Grubbs检验法）识别并剔除异常值，从而提高最终结果的准确度。

 3、反应条件的控制
显色反应的强度受孵育温度与时间影响显著。为获得稳定的结果，应确保孵育过程在恒温（如37℃）及规定时间内完成。鉴于反应条件可能存在的细微波动，每次实验均需同步绘制全新的标准曲线。

 4、标准曲线的绘制
绘制标准曲线时，须明确设置坐标轴：横坐标（X轴）为标准蛋白质浓度，纵坐标（Y轴）为对应吸光度值。需确保数据点分布均匀并处于线性范围内，避免坐标轴误用导致的定量错误。

 5、加样操作的规范性
加样过程需精确、匀速，尽量避免产生气泡。若孔内出现气泡，可使用微量注射器针头轻轻戳破，或将酶标板置于微量振荡器上短暂轻摇，以使溶液混合均匀并消除气泡，防止其对吸光度读数造成干扰。

 6、吸光度的及时测定
显色反应完成后，应尽快将酶标板冷却至室温并在短时间内完成所有孔的吸光度测定。延迟测定可能导致反应产物不稳定，从而引入测量误差。

 7、样品的预处理
若预实验表明待测样品蛋白质浓度超出标准曲线线性范围，需使用适当的缓冲液（如磷酸盐缓冲液）对其进行梯度稀释，使稀释后样品的预期浓度落入标准曲线中部线性最佳区间，最后计算结果时乘以相应的稀释倍数。

乐备实（上海优宁维生物科技股份有限公司旗下全资子公司），是国内专注于提供高质量蛋白检测以及组学分析服务的实验服务专家，自2018年成立以来，乐备实不断寻求突破，公司的服务技术平台已扩展到单细胞测序、空间多组学、流式检测、超敏电化学发光、Luminex多因子检测、抗体芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫组化、DSP空间多组学等30多个，建立起了一套涵盖基因、蛋白、细胞以及组织水平实验的完整检测体系。

 
我们可提供从样本运输、储存管理、样本制备、样本检测到检测数据分析的全流程服务。凭借严格的实验室管理流程、标准化实验室操作、原始数据储存体系以及实验项目管理系统，已经为超过3000家客户单位提供服务，年检测样本超过100万，受到了广大客户的信任与支持。