一、引言

  酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是将抗原-抗体的特异性免疫反应与酶的高效催化作用相结合的一种高灵敏度检测技术。自其建立以来，该技术凭借其操作相对简便、检测通量高以及无需复杂放射性同位素防护等优势，已成为生命科学基础研究、临床诊断及食品安全检测等领域中不可或缺的分析工具。本文旨在系统阐述该技术的核心原理、主要类型、关键优化策略及其在相关领域中的应用进展。

二、试剂与耗材清单及操作要点

（一）实验试剂与耗材准备

  实验所需试剂包括：预包被或待包被酶标板、待测样本、标准品、捕获抗体、检测抗体、酶标二抗、洗涤液（如1× TBST）、封闭液（如5%脱脂奶粉或1% BSA）、底物溶液（如TMB A/B液）以及终止液（如1–2 M硫酸）。

  常用耗材包括：无菌离心管、移液器吸头、封板膜等。

（二）操作前注意事项

  👉试剂状态检查：所有液体试剂在使用前应仔细检查，确保溶液澄清、无沉淀物或其他污染迹象。标准品、抗体及酶结合物应避免反复冻融，以免影响其生物活性。

  👉试剂平衡与溶解：试剂从4℃储存环境中取出后，应在室温下平衡至少30分钟，以消除温度差异对反应效率的潜在影响。如发现浓缩洗涤液出现结晶，可将其置于不超过50℃的水浴中（建议40℃）加热溶解，充分混匀后再行使用。

  👉标准品处理：标准品应提前溶解并按照实验要求进行梯度稀释，避免反复冻融操作，以确保标准曲线的准确性和重复性。

  👉酶标板的保存：如使用可拆卸酶标板条，在取出所需板条后，剩余板条应立即放回含有干燥剂的铝箔袋中，密封保存，以防止受潮影响后续使用效果。

三、生物样本的采集与处理方法

（一）血清样本的制备

  ✔️采集与分离：采用无热原、无内毒素的离心管收集全血样本。采集后可将血液置于室温静置2小时，或于4℃过夜使其自然析出。随后在2–8℃条件下，以1000×g离心20分钟，小心收集上层血清。

  ✔️注意事项：为提高血清分离效率，可倾斜离心管以扩大液体的横截面积。操作过程中应避免剧烈摇晃，防止溶血现象发生；红细胞裂解释放的内源性过氧化物酶可能干扰基于HRP的检测体系，导致非特异性显色。

  ✔️保存方式：血清样本若短期内使用，可置于2–8℃冷藏保存；如需长期保存，应分装后置于-20℃或-80℃冻存，并避免反复冻融。

（二）血浆样本的制备

  👉采集与分离：使用含EDTA钠盐、肝素钠或枸橼酸钠的抗凝管采集全血。采集后30分钟内，在2–8℃条件下以1000×g离心15分钟，收集上层血浆。

  👉注意事项：实验前应确认所用试剂盒对抗凝剂类型无特殊限制。样本应尽量避免溶血或高血脂，以免影响检测结果的准确性。

  👉保存方式：血浆样本可于2–8℃短期保存，或分装后于-20℃/-80℃冻存，注意避免反复冻融。

（三）细胞培养上清的收集

  ✔️收集与处理：直接吸取细胞培养上清液至离心管中，在2–8℃条件下以1000×g离心20分钟，去除残留的细胞碎片及其他杂质，收集澄清上清液备用。

  ✔️保存方式：收集后的上清液可于2–8℃短期保存，或分装后于-20℃/-80℃冻存，避免反复冻融。

（四）细胞裂解液的制备

  👉细胞收集：对于贴壁细胞，弃去培养基后经胰蛋白酶消化，用培养基吹打使其悬浮；悬浮细胞则可直接收集。将细胞悬液在2–8℃条件下以1000×g离心5分钟，弃上清，并用预冷的PBS洗涤3次。

  👉细胞重悬：向洗涤后的细胞沉淀中加入适量预冷PBS（可添加蛋白酶抑制剂），重悬细胞。以6孔板为例，每孔约1×10⁶细胞可加入150–250 μL缓冲液。

  👉裂解方法：

反复冻融法：将细胞悬液置于-80℃（或液氮）与30℃水浴中交替冻融2–3次；

超声破碎法：在冰浴条件下进行超声处理，参数设置为200 W超声2秒/次，间隔3秒，总时长3–5分钟。

  👉收集与保存：裂解完成后，于2–8℃条件下以1500×g离心10分钟，收集上清液。所得裂解产物应分装后于-20℃或-80℃冻存，并避免反复冻融。

四、实验核心操作流程

  1、抗体包被步骤

使用包被缓冲液（如PBS或CBS）将捕获抗体稀释至适宜工作浓度（推荐范围为0.5–20 μg/mL）。向酶标板各孔中加入100 μL稀释后的抗体溶液，并于4℃过夜孵育或37℃条件下孵育2小时。若采用4℃过夜孵育，需使用封板膜密封酶标板，以防止液体蒸发。

  2、非特异性位点封闭

孵育结束后弃去包被液，使用TBST洗涤酶标板2–3次，每次浸泡3–5分钟。随后向各孔中加入200–350 μL封闭液（常用5%脱脂奶粉或1% BSA），确保液体完全覆盖孔底，并避免气泡产生。室温孵育1小时或4℃过夜完成封闭。

  3、样本与标准品加样及孵育

将待测样本与标准品用相应稀释液稀释后，于各孔中加入100 μL。加样时应将液体加至孔底，避免触及孔壁或产生气泡。更换不同样本时必须更换移液器吸头，以防交叉污染。建议每个样本设置至少2个复孔，并控制变异系数（CV）不超过20%。加样完成后于37℃孵育1–2小时。孵育过程优先选用恒温培养箱，酶标板应单层平铺，避免叠放，以保证各孔受热均匀。

  4、洗涤操作

弃去孔内反应液，使用TBST洗涤3–5次，每次浸泡1–2分钟。最后一次洗涤后，将酶标板倒置，在干净吸水纸或滤纸上轻拍，以去除孔内残留液体。洗涤过程中应避免液体溢出，防止相邻孔间交叉污染；甩板时垂直用力，可配合120–150度旋转动作，确保液体彻底清除。人工操作时建议使用吸水纸或滤纸拍干，避免使用卫生纸等易产生粉尘的材料。

  5、检测抗体加样

向各孔中加入100 μL酶标检测抗体（如HRP标记抗体）或生物素标记抗体，于37℃孵育30–60分钟。使用二抗时，应确保其与捕获抗体的种属来源相匹配（例如，捕获抗体为小鼠源，则选择抗小鼠的HRP标记二抗）。

  6、显色、终止与读数

将TMB底物A液与B液按1:1比例混合后，向各孔中加入100 μL，避光孵育10–15分钟，待孔内液体呈现蓝色。随后加入终止液（如1 M硫酸）终止反应，液体颜色由蓝转黄。终止后应立即使用酶标仪测定吸光度值，检测波长设置为450 nm，或采用450/630 nm双波长校正。

  7、数据处理与结果计算

以标准品浓度为横坐标，对应吸光度值为纵坐标，拟合四参数逻辑曲线（4-PL）绘制标准曲线。根据样本的吸光度值，通过标准曲线计算其浓度。

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