摘要：

先导编辑（Prime Editing, PE）作为2019年刘如谦团队建立的精准基因编辑技术，可在无DNA双链断裂、无需外源供体DNA条件下实现基因组定点碱基替换、片段插入与缺失，在遗传病临床治疗、基础生物学及作物育种领域具备巨大应用潜力，但pegRNA胞内易被核酸酶降解导致编辑效率不足是制约其临床落地的关键瓶颈。该研究由哈佛大学、博德研究所刘如谦课题组于2026年发表在Nature Biotechnology，构建高通量筛选平台PE-PRISM，通过文库筛选+结构导向定向进化获得3种新型小型RNA稳定基序（tevo2.0、eHAV、eSBRMV1-A）；相较于传统商用tevopreQ1基序，新基序可显著提升pegRNA稳定性，在超90%致病ClinVar突变位点实现编辑效率优化，在脂质纳米颗粒（LNP）、工程化病毒样颗粒（eVLP）递送的人原代细胞、小鼠体内（肝脏/脑组织）中均验证广谱增效效果，为下一代体内基因治疗先导编辑系统优化提供全新策略。

一、引言

CRISPR-Cas9介导的传统基因编辑依赖DNA双链断裂，易诱发脱靶突变、染色体异常等安全风险；2019年刘如谦团队在Nature首次报道先导编辑技术，依托Cas9切口酶与逆转录酶融合蛋白、pegRNA协同作用，仅对靶DNA单链切口，依靠pegRNA携带的PBS引物区与逆转录模板完成定点基因改写，从原理上规避双链断裂隐患，已进入慢性肉芽肿病等单基因遗传病临床试验，实现造血干细胞NCF1致病缺失碱基精准修复，恢复NADPH氧化酶生理活性。

先导编辑系统优化过往聚焦Cas9-逆转录酶融合蛋白的突变改造，而pegRNA 3'端保护元件长期被忽视：pegRNA同时承担靶位点识别与编辑模板携带双重功能，哺乳动物细胞内富含各类核酸水解酶，游离pegRNA极易被降解；现有常用保护基序tevopreQ1体积偏大、RNA体外合成成本高，且防护效率已达技术天花板，限制PE在原代细胞与活体动物体内编辑效率提升。因此，该研究立足pegRNA稳定性改造，开发高通量筛选平台定向进化小型抗降解RNA基序，从RNA层面突破先导编辑效率瓶颈。

二、材料与方法  

（一）PE-PRISM高通量筛选平台构建

建立PE-PRISM（Prime Editing Pooled RNA In Situ Maturation screening）混合筛选体系，以人源细胞（HEK293T）为筛选底盘细胞，构建4轮迭代RNA基序文库，文库涵盖2858种天然/人工改造RNA元件，包含假结（Pseudoknot）、G-四链体、病毒来源逆转录酶招募RNA元件三大类天然结构化RNA基序，所有候选序列统一连接至pegRNA 3'末端，利用报告基因荧光读数量化对应PE编辑效率，初筛获得具备抗核酸酶降解潜力的优势候选RNA基序。

（二）候选基序定向进化与结构优化

对初筛阳性候选基序开展结构定点诱变+组合突变筛选：依托RNA二级/三级结构预测，靶向假结茎环、环区关键碱基进行单点/多点突变，多轮细胞水平编辑效率复筛，定向进化得到紧凑型优化变体：tevo2.0（改良假结结构）、eHAV（甲肝病毒来源改造RNA元件）、eSBRMV1-A（沙粒病毒衍生工程化RNA）。

（三）广谱编辑效率验证体系

（1）体外细胞筛选：选取ClinVar数据库847种人类致病基因突变位点，分别构建搭载tevopreQ1（对照组）、3种新型RNA基序的pegRNA，在HEK293T中平行检测定点编辑效率；

（2）原代细胞验证：分离人源原代造血细胞、肝细胞，采用LNP脂质纳米颗粒包裹PE系统递送；

（3）体内动物实验：采用eVLP工程化病毒样颗粒递送PE系统，靶向小鼠肝脏、脑组织致病位点，活体检测基因修复效率。

（4）egRNA稳定性检测 qRT-PCR定量胞内剩余pegRNA丰度，对比对照组与新基序修饰组pegRNA半衰期、胞内残留量，从RNA稳定性层面解析增效分子机制。

三、实验结果  

（一）PE-PRISM筛选获得高活性小型RNA稳定基序

经4轮文库迭代筛选与定向进化，最终筛选出tevo2.0、eHAV、eSBRMV1-A三类优势RNA基序，三者分子尺寸显著小于传统tevopreQ1，降低pegRNA化学合成难度与生产成本；在847个ClinVar致病突变位点筛选中，新基序组合在90%以上靶点的编辑效率优于经典tevopreQ1，部分位点编辑效率提升2~5倍。  

Sakai HA, Pierce SE, et al. Directed evolution of small RNA-stabilizing motifs that improve prime-editing efficiency. Nat Biotechnol. 2026 May 20.

（二）新型基序通过提升pegRNA稳定性实现增效

RNA定量结果显示：3种优化基序可通过形成紧凑空间三级结构屏蔽胞内5'→3'外切酶、内切酶识别位点，显著提升pegRNA细胞半衰期；PEmax、PE7两种主流先导编辑骨架下，搭载新基序的pegRNA胞内丰度整体高于tevopreQ1对照组，证实RNA稳定性提升是编辑效率上调的核心机制。

（三）多递送系统、多细胞/组织广谱增效

（1）人原代细胞：LNP递送体系下，新基序修饰PE系统在人原代肝细胞、造血干细胞致病位点修复效率较传统体系提升1.8~3.2倍；

（2）小鼠体内模型：eVLP介导体内递送，小鼠肝脏基因突变编辑效率由15%（tevopreQ1组）提升至38%~45%，大脑神经元定点编辑效率由9%提升至27%以上；

（3）通用性：无论质粒瞬时转染、LNP非病毒递送、eVLP病毒样颗粒递送，三类基序均稳定发挥增效作用，无明显递送体系依赖。  

Sakai HA, Pierce SE, et al. Directed evolution of small RNA-stabilizing motifs that improve prime-editing efficiency. Nat Biotechnol. 2026 May 20.

四、讨论  

（一）该研究创新点

过往先导编辑优化集中于Cas9-逆转录酶融合蛋白改造，该研究首次聚焦pegRNA 3'端稳定元件的定向进化优化，开创先导编辑效率升级新路径；自研PE-PRISM高通量筛选平台实现近3000种RNA元件一站式功能筛选，大幅缩短RNA基序开发周期；进化得到的紧凑型RNA基序兼顾小分子尺寸、高稳定性、低成本合成三大优势，解决传统tevopreQ1基序体积大、合成困难的痛点。

（二）临床转化价值

现有先导编辑已进入遗传病临床试验，但原代细胞与体内编辑效率偏低制约临床疗效；该研究优化的RNA基序可直接兼容现有PEmax、PE7等成熟先导编辑骨架，无需改造蛋白序列即可快速升级现有基因治疗候选药物，针对镰状细胞贫血、亨廷顿舞蹈症、遗传性肝病等单基因遗传病的体内基因治疗提供现成优化方案；同时在动植物精准育种、基础基因功能敲入/敲除实验中具备广泛落地空间。

（三）局限性与后续研究方向

（1）位点偏好性：部分极端GC含量靶点中单一最优基序不存在，后续需根据靶序列特征个性化搭配eHAV/tevo2.0/eSBRMV1-A组合；

（2）灵长类验证缺失：该研究仅完成小鼠体内实验，后续需开展非人灵长类动物体内编辑安全性与有效性评价，加速临床前研究；

（3）作用细节待深挖：新型RNA基序除抗核酸酶外，是否通过调控pegRNA与逆转录酶相互作用进一步优化逆转录效率，仍需结构生物学解析验证。

五、结论

该研究依托自主构建的PE-PRISM高通量筛选平台，经定向进化获得tevo2.0、eHAV、eSBRMV1-A三种新型小型RNA稳定基序，通过保护pegRNA免于胞内核酸酶降解实现先导编辑效率系统性提升；新基序在体外细胞、人原代细胞、小鼠肝/脑组织中经LNP、eVLP多递送方式验证广谱增效能力，突破传统tevopreQ1基序性能瓶颈。基于RNA基序定向进化优化pegRNA是高效改良先导编辑的可靠策略，该成果大幅推动先导编辑从实验室基础研究向体内精准基因治疗落地转化，为下一代精准基因编辑工具开发提供新思路。

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