前言
铁死亡作为铁离子依赖的氧化型程序性细胞死亡，其释放损伤相关分子模式（DAMPs）介导无菌炎症是肿瘤、胰腺炎等疾病核心病理机制，但铁死亡早期分泌蛋白全景尚不清晰，单因子 ELISA、WB 等低通量手段难以系统性筛选潜在炎症介质。本篇高分（IF=14.6，Autophagy）研究依托高通量抗体芯片，以细胞上清为检测样本，批量筛选铁死亡诱导后分泌蛋白谱，锁定核心 DCN 分子，完整阐明「铁死亡 - 自噬 - DCN 分泌 - AGER 炎症轴」，为铁死亡炎症机制研究提供标准化高通量蛋白筛选范式。
一、研究基础信息
1、期刊：Autophagy
2、影响因子：14.6
3、论文标题：DCN released from ferroptotic cells ignites AGER-dependent immune responses
4、一作：Jiao Liu
5、通讯作者：Rui Kang
6、合作单位：广州医科大学第三附属医院 DAMP 生物学中心、中南大学湘雅三医院儿科、陆军特色医学战伤复合伤国家重点实验室等多家机构
7、核心检测技术：高通量抗体芯片
8、检测样本：肿瘤细胞培养上清
二、研究背景与科学问题
生理性细胞死亡维持组织稳态，但过度细胞死亡释放 DAMPs 会触发持续性无菌炎症。铁死亡是高度促炎的细胞死亡类型，巨噬细胞胞葬难以彻底清除铁死亡细胞，其释放的信号分子驱动多种炎症疾病发生。目前学界尚不明确铁死亡特异性分泌 DAMP 分子，且铁死亡激活免疫应答的分子、细胞通路缺乏完整解析。本研究借助高通量抗体芯片无差别筛选铁死亡上清分泌蛋白，挖掘特异性损伤信号并解析上下游调控通路。
三、核心实验体系与分层研究结果
（1）高通量抗体芯片初筛：锁定铁死亡特异性早期分泌蛋白 DCN
研究选取 HT1080、HeLa 两种人肿瘤细胞，设置 erastin 铁死亡诱导组与空白对照组，收集细胞上清使用抗体芯片完成全分泌蛋白谱扫描。
1、细胞表型验证：HT1080 对 erastin 诱导铁死亡敏感度显著高于 HeLa，铁死亡发生后上清蛋白释放总量大幅上升；
2、芯片筛选结果：两种细胞铁死亡模型中共同上调分泌核心蛋白为蛋白多糖核心蛋白聚糖 DCN；
3、释放时序验证：对比 LDH（细胞坏死终末标志物）、HMGB1（晚期 DAMP），DCN 在铁死亡刺激 3h 内即可释放，是铁死亡早期特异性分泌标志物，可区分早期铁死亡与晚期细胞裂解坏死。
（2）自噬通路调控铁死亡过程 DCN 释放
基于芯片筛选结果，探究 DCN 早期分泌的分子调控机制，围绕自噬通路开展基因与药物验证：
1、相关性证据：自噬标志蛋白 MAP1LC3B-II 表达水平与上清 DCN 分泌量显著正相关；
2、基因敲除验证：atg5-/-、atg7-/-、rb1cc1-/- 细胞自噬通路缺陷，erastin/RSL3 处理后细胞死亡程度、DCN 分泌量均显著被抑制；
3、结论：完整自噬流是铁死亡早期 DCN 释放的必要条件。
（3）DCN 作为专属 DAMP 介导巨噬细胞促炎应答
构建铁死亡细胞与小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）共培养体系，验证 DCN 的炎症激活功能：
1、对比 WT 与 dcn-/- 铁死亡细胞：缺失 DCN 的铁死亡细胞无法有效诱导 BMDMs 分泌 TNF、IL6 促炎因子；
2、中和抗体实验：DCN 特异性单抗处理可显著削弱巨噬细胞炎症因子释放；
3、对照验证：抗 DCN 抗体对凋亡、坏死细胞刺激的巨噬细胞炎症无抑制效果，证明 DCN 是铁死亡独有的功能性 DAMP 分子。
（4）AGER 受体介导 DCN 下游 NF-κB 炎症信号轴
筛选巨噬细胞表面 DCN 功能性受体，解析下游转录通路：
1、受体干扰筛选：使用 shRNA 分别沉默 EGFR、TLR2/4、AGER 等 8 种潜在受体，仅 AGER 敲低可显著阻断铁死亡细胞诱导的 TNF、IL6 分泌；
2、转录水平验证：DCN 刺激可激活 WT 巨噬细胞 NF-κB 转录活性，ager 敲除细胞无此应答；
3、分子互作：His 标签 Pull-down 体外实验直接证实 DCN 蛋白与 AGER 存在直接结合，明确 DCN-AGER 互作是炎症启动关键分子开关。
四、全文研究结论
本研究依托 AAH-BLG-1 高通量 507 因子抗体芯片对铁死亡细胞上清分泌蛋白进行无偏筛选，首次鉴定 DCN 为铁死亡早期特异性释放 DAMP 分子；自噬通路介导铁死亡进程中 DCN 的胞外分泌，分泌型 DCN 结合巨噬细胞表面 AGER 受体，激活 NF-κB 信号通路，大量释放 TNF、IL6 等促炎因子；药物 / 基因层面阻断 DCN-AGER 信号轴，既能缓解铁死亡相关胰腺炎，也会削弱铁死亡肿瘤细胞诱导的抗肿瘤免疫应答，为铁死亡相关炎症疾病、肿瘤免疫干预提供全新靶点。
五、铁死亡机制研究中细胞上清多因子、高通量分泌蛋白筛选检测服务哪里可承接？
乐备实 LabEx 可提供高通量抗体芯片检测服务，适配 HT1080、HeLa、THP-1、Jurkat 等各类肿瘤 / 免疫细胞上清样本，支持铁死亡、细胞焦亡、巨噬细胞炎症、肿瘤微环境等方向批量蛋白筛选，可同步完成芯片上机、荧光扫描、定量数据分析并出具完整标准化实验报告，同时配套 Luminex 多因子、流式、PLA等配套蛋白验证实验一站式技术支持。
| 服务货号 | 中文名称 | 应用方向 | 检测指标 |
|---|---|---|---|
| LXAH049-1 | 人 RTK 磷酸化抗体芯片 Panel (49 因子) | RTK 磷酸化 | ALK/CD246,EphB4,MuSK,Axl,EphB6,PDGF R alpha,DDR1,ErbB2,PDGF R beta,DDR2,ErbB3,c-Ret,Dtk,ErbB4,ROR1,EGF R,FGF R1,ROR2,EphA1,FGF R2 alpha,Ryk,EphA2,FGF R3,SCF R/c-kit,EphA3,FGF R4,Tie-1,EphA4,Flt-3,Tie-2,EphA5,HGF R/c-MET,TrkA,EphA6,IGF-I R,TrkB,EphA7,Insulin R/CD220,TrkC,EphA10,M-CSF R,VEGF R1/Flt-1,EphB1,Mer,VEGF R2/KDR,EphB2,MSP R/Ron,VEGF R3/Flt-4,EphB3 |
| LXAH041-1 | 人磷酸激酶抗体芯片 Panel (41 因子) | 磷酸激酶 | Akt 1/2/3 (S473),HSP60,PRAS40 (T246),Akt 1/2/3 (T308),JNK 1/2/3 (T183/Y185,T221/Y223),Pyk2 (Y402),beta-Catenin,Lck (Y394),RSK1/2 (S221/S227),Chk-2 (T68),Lyn (Y397),RSK1/2/3 (S380/S386/S377),c-Jun (S63),MSK1/2 (S376/S360),Src (Y419),CREB (S133),p38 alpha (T180/Y182),STAT1 (Y701),EGF R (Y1086),p53 (S15),STAT2 (Y689),eNOS (S1177),p53 (S392),STAT3 (S727),ERK1/2 (T202/Y204,T185/Y187),p53 (S46),STAT3 (Y705),Fgr (Y412),P70 S6 Kinase (T389),STAT5a/b (Y699),GSK-3 alpha/beta (S21/S9),p70 S6 Kinase (T421/S424),STAT6 (Y641),GSK-3 beta (S9),PDGF R beta (Y751),WNK-1 (T60),HSP27 (S78/S82),PLC gamma-1 (Y783),Yes (Y426) |
| LXAH059-1 | 人免疫受体磷酸化抗体芯片 Panel (59 因子) | 免疫受体 | 2B4/SLAMF4,FcRH1/IRTA5,NKp46/NCR1,BLAME/SLAMF8,FcRH2/IRTA4,NKp80/KLRF1,BTLA,FcRH4/IRTA1,NTB-A/SLAMF6,CD3 epsilon,FcRH5/IRTA2,PD-1,CD5,ILT2/CD85j,PECAM/CD31,CD6,ILT3/CD85k,SHIP-1,CD28,ILT4/CD85d,SHP-1,CD84/SLAMF5,ILT5/CD85a,SHP-2,CD229/SLAMF3,ILT6/CD85e,Siglec-2/CD22,CEACAM-1,Integrin beta 3/CD61,Siglec-3/CD33,CLEC-1,KIR2DL4,Siglec-5,CLEC-2,LAIR-1,Siglec-7,CRACC/SLAMF7,LAIR-2,Siglec-9,CTLA-4/CD152,LMIR1/CD300A,Siglec-10,DCIR/CLEC4A,LMIR2/CD300C,SIRP-beta 1,Dectin-1/CLEC7A,LMIR3/CD300LF,SLAM/CD150,DNAM-1,LMIR6/CD300LE,TREM-1,Fc epsilon RII/CD23,MDL-1/CLEC5A,TREM-2,Fc gamma RIIA,NKp30/NCR3,TREML1/TLT-1,Fc gamma RIIIA/B,NKp44/NCR2 |
| LXAH036-1 | 人细胞凋亡抗体芯片 Panel (36 因子) | 凋亡相关 | Bad,TRAIL R1/DR4,PON2,Bax,TRAIL R2/DR5,p21/CIP1/CDNK1A,Bcl-2,FADD,p27/Kip1,Bcl-x,Fas/TNFSF6,Phospho-p53 (S15),Pro-Caspase-3,HIF-1 alpha,Phospho-p53 (S46),Cleaved Caspase-3,HO-1/HMOX1/HSP32,Phospho-p53 (S392),Catalase,HO-2/HMOX2,Phospho-Rad17 (S635),cIAP-1,HSP27,Pro-Caspase-3,-cIAP-2,HSP60,SMAC/Diablo,Claspin,HSP70,Survivin,Clusterin,HTRA2/Omi,TNF RI/TNFRSF1A,Cytochrome c,Livin,XIAP |
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