多重细胞因子检测已成为抗肿瘤疗效评估的首选利器!
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细胞因子由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应,调控免疫应答。通常在患者组织中检测单个具有标志性的细胞因子,以了解免疫系统在清除肿瘤中的效果;且即使在发现肿瘤负荷变化之前,细胞因子的检测也能在一定程度上反应该效果。单个细胞因子也可以抑制或促进肿瘤生长的活性,检测多种不同的细胞因子则能更好地反映抗肿瘤活性,以T细胞为基础的治疗为例:相关细胞在消除肿瘤前后会分泌不同的细胞因子。

细胞因子的检测常常被用作各项疾病中预测免疫反应强度的生物标志物。而单个细胞因子在集体免疫中常常可以表现出两面性,例如:IFN-γ和TGF-β都与促肿瘤和抗肿瘤功能有关。此外,不同细胞来源的细胞因子会影响CD4+CD8+ T细胞之间的串扰,而T细胞表达的细胞因子阵列也有助于确定治疗的作用机制和疗效,因此,多重细胞因子检测方法及相关因子的验证在疾病免疫及治疗中逐渐起到了至关重要的作用。

肿瘤微环境(TME)表现为高度抗炎性、免疫抑制细胞因子IL-10促进肿瘤扩张。免疫监测期间,通常根据单个细胞因子的丰度来预测结果,特别是IFN-γ或TGF-β:IFN-γ具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节的特性;TGF-β可以作为肿瘤抑制因子,诱导细胞凋亡,抑制癌前细胞和癌细胞的增殖。TGF-β与IFN-γ的相互作用可作为肿瘤治疗和免疫活性TME有效性的指标。然而,单个细胞因子不能充分确定TME的持续免疫,除IL-10TGF-β和IFN-γ外,TME内多种细胞因子的协同作用是决定抗肿瘤免疫应答程度和成功率的主要因素。因此,有必要扩大对细胞因子功能的解读,以期了解这些生物标志物在激活相应免疫细胞和建立抗肿瘤免疫中的真正广度和作用。

美国西北大学范伯格医学院一项研究通过一组细胞因子的检测来描绘对肿瘤细胞持续免疫反应的图像,详细描述了T细胞在临床上作为抗肿瘤治疗的功能。

结果与讨论

1、T细胞源性细胞因子作为抗肿瘤活性的生物标志物

大多数研究将CD107a作为细胞毒性活性的替代标记物。CD107a(也称为LAMP-1)作为NK、γδT细胞和细胞毒性T细胞表达的细胞毒性活性的替代标记物,在脱颗粒后短暂存在于细胞表面。NK细胞有助于介导肿瘤细胞清除和病毒感染。CD107a的表达与IFN-γ和TNF-α的表达以及T细胞的细胞毒性一致,并且在活化的NK细胞上同样上调,因此作为一般NK功能活性标记物发挥作用。

细胞因子标记物组合可以提供关于T细胞在肿瘤内活力信息,T细胞是每种细胞因子的主要来源,在T细胞衍生的生物标志物中,Th1细胞因子IFN-γ、IL-2TNF-α是治疗反应最显著的标志物(如表1所示)。

2、IFN-γ和TGF-β的两面性

在许多可用的细胞因子中,IFN-γ和TGF-β之间的平衡在决定TME内的促肿瘤与抗肿瘤特性和结果方面起着关键作用。然而,仅仅测量TMEIFN-γ或TGF-β的分泌量不足以准确地描述TME的抗肿瘤潜能。IFN-γ是Th1细胞、CD8+T细胞、γδT细胞、NKT细胞、NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞产生的标志性细胞因子。IFN-γ的生物学功能来源于其与IFN-γ受体IFNGR1IFNGR2的相互作用。TGF-β是参与淋巴器官和免疫系统的标志性细胞因子,在维持T细胞稳态中起着关键作用。TGF-β信号依赖于TME内的环境线索,高水平的IFN-γ是“功能良好的T细胞”的重要指标,在某种程度上,TGF-β的时间丰度也是其佐证。

3、CD4+和CD8+T细胞的相互作用决定了TME的免疫反应

TME内的治疗性T细胞可根据其释放的细胞因子显示不同水平的疗效,最终定义了该类T细胞的功能范围。CD4+CD8+T细胞之间存在相互支持的关系,这两种细胞类型都依赖抗原表达启动抗肿瘤免疫。CD4+T细胞被定义为辅助性(Th)或抑制性T细胞,它们表达独特的转录因子,参与了每个亚群相关的特定细胞因子基因的转录。最常与抗肿瘤反应相关的CD4+T细胞包括Th1Th9Th17细胞,它们驱动细胞介导的反应,而Th2细胞被认为在抑制肿瘤方面的适应性免疫反应不太有效。相反,免疫抑制的CD4+Tregs在免疫耐受中起着不可或缺的作用。Th22 T细胞与不良预后相关,并且同样干扰正在进行的抗肿瘤免疫。

4、T细胞多功能性

T细胞亚群相关转录因子被认为是T细胞分类的主要指标。T细胞分类通常依赖于流式细胞术分析的细胞表面糖蛋白组合的表达,这种表面分子阵列与特定的功能特征相一致,允许根据其激活状态对T细胞进行分类,包括识别其产生的细胞因子。产生多种细胞因子的能力取决于T细胞的TCR结合亲和力和抗原敏感性。T细胞多功能性,即产生多种细胞因子的能力,增强了对传染病和接种疫苗后的免疫反应,但其具体机制尚不清楚。

1显示了人类黑色素瘤肿瘤与丰富的T细胞。这说明了需要用T细胞功能的例子来说明T细胞的丰度,以了解肿瘤进展的本质。

T细胞衍生的生物标志物中,Th1细胞因子IFN-γ、IL-2TNF-α是治疗反应最显著的标志物。如表1所示:这些和其他细胞因子(以多功能方式)的协同作用可以产生对细胞因子治疗的积极、有效的反应。

CD8+T效应细胞分为两大类:CD8+1型(Tc1)细胞,主要产生IFN-γ和TNF-α;2型(Tc2)细胞,产生IL-4IL-5IL-10IL-13Tc1细胞通过释放穿孔素和颗粒酶B阻断靶抗原携带功能,突触接收信号后T细胞分泌细胞因子,如IFN-γ和TNF-α,以进一步诱导免疫反应。另一方面,Tc2细胞常常加重疾病,只能介导低水平的细胞毒性。因此,1型细胞因子与强大的细胞毒性有关,并建立持久的抗肿瘤免疫。

如表2 为目前常用于细胞因子检测的产品在对患者检测结果的比对分析:

流式细胞术或荧光激活细胞分离技术(FACS)是一种常用的技术,可以通过细胞内细胞因子染色(ICS)在每个细胞的基础上提供定量信息。ICS是细胞反应,特别是T细胞反应可视化的标志性方法。但这种技术缺乏检测低水平细胞因子的敏感性。流式细胞术不能确定细胞因子在哪里被释放,也不能确定化学阻止分泌产生的人工备份是否影响细胞因子的下游生产。CyTOF(质谱仪)是最近发展起来的一种技术,它采用了流式细胞仪(FC)的格式,利用质谱的精确度,并且能够在单个细胞水平上对每个样本中超过40个细胞参数的数百万个细胞进行平行测量。CyTEK提供了一种更易于使用的替代技术,利用光谱分析来分离接近最大发射波长的荧光色素。

另一种细胞因子检测技术是定量聚合酶链反应(qPCR),需要特异的探针从大量RNA中检测细胞因子转录物。随着下一代测序(NGS)技术如核糖核酸(RNA)测序(RNA-seq)的出现,可以进行无偏差的多靶点分析,并且可以检测到罕见的细胞因子转录物。大量RNA分析存在一些缺点,例如无法确定基因的来源,无法揭示实际蛋白质是否产生和分泌,并且缺乏对TME或细胞因子分泌的整体分析。

酶联免疫吸附试验(ELISA)是测定生物液体或组织培养上清液中分泌细胞因子总浓度的又一种分析方法。然而,这种大量细胞因子估计方法不能提供单细胞水平的信息。酶联免疫斑点分析(ELISPOT)确实主要报告细胞因子产生细胞的定性数据,从而在单细胞水平上获得有关激活细胞和多种分泌细胞因子数量的数据。用于多重细胞因子检测的分析平台,如LuminexMeso-Scale DiscoveryMSD),Luminex是一种基于珠的免疫分析方法,其中荧光珠涂有针对特定分析物的捕获抗体,并与样品一起孵育。MSD免疫分析是一种基于夹心ELISA的升级方法,其中使用磺基标记结合检测抗体而不是荧光结合抗体来检测分析物,与传统的ELISA相比,具有高灵敏度和低样品使用量的优势!

用多重细胞因子检测的分析平台检测细胞因子和基于细胞因子的抗肿瘤免疫疗法,特别是基于多功能T细胞的疗法,已逐渐显示出在TME内再生免疫应答的前景。

展望

细胞因子检测是一个强大的工具,通过定制识别对各种癌症治疗产生积极反应的细胞因子的独特组合,研究人员可以改进靶向和攻击肿瘤的方法。进一步研究探索和鉴定细胞因子,使用单细胞细胞因子监测技术可以提高在描述TME内持续免疫的精确度,或许可以重新设计建立抗肿瘤免疫的方式。


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