肿瘤药物筛选?标志物筛查+组化分析轻松搞定!
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上皮性卵巢癌 (EOC) 是最致命的妇科恶性肿瘤,研究表明,使用小分子抑制剂靶向 RNA 聚合酶 I (POL I) 是对抗 EOC 的可行治疗方法。CX-5461 是目前正在研究的最有希望的 POL I 抑制剂之一,有报道表明:CX-5461 治疗通过 ATM/ATR 激酶诱导 DNA 损伤反应 (DDR)。
美国弗吉尼亚大学妇产科建立了疾病模型,使用 CX-5461 诱导细胞质 dsDNA 的积累,从而激活 cGAS-STING-TBK1-IRF3 先天免疫途径,进而诱导 I 型干扰素。证明了CX-5461 治疗介导的免疫激活可能是一种强大的作用机制,可以开发出新的药物组合,有望提高 EOC 免疫治疗效果。

CX-5461 的胞质 DNA 积累导致胞质 DNA 检测系统和响应途径的下游激活,包括 STING。胞质 DNA 被环状 GMP-AMP 合酶 (cGAS) 检测到并激活 STING 信号,从而导致 I 型干扰素反应,CX-5461 诱导 CXCL10 和 IL-6 的转录。敲除 STING 和 cGAS 会消除 CX-5461 诱导的 CXCL10 和 IL-6 转录。进一步表明 CX-5461 在异种移植模型中降低了肿瘤负荷,增加 STING 染色并激活某些细胞因子的转录。

以下是作者的整体实验思路!

CX-5461 诱导细胞质 DNA 积累

作者使用 IC50 剂量的 CX-5461、BMH-21、卡铂、紫杉醇或替莫唑胺处理 COV362 细胞,并用 Sir Hoechst 染色。对细胞质 DNA 染色阳性的细胞进行计数和定量(图1E)。与其他药物相比,CX-5461 处理显著诱导细胞质 DNA 阳性细胞损伤反应,导致 G2 期延迟。

RNA-seq 分析

对用 CX-5461 处理 24 小时的 HeyA8 细胞进行了 RNA-seq 分析。使用序列计数数据的基因集关联分析进行的下游分析表明,CX-5461处理导致核糖体信号的预期丢失、胞浆DNA检测系统的上调以及IFNA信号的激活。
其中COV362 和 HeyA8 细胞用 CX-5461 处理 24 或 48 小时,收获细胞并使用 TRIZOL 分离 RNA。进行IL-6和CXCL10的RT-PCR。过程略显繁琐,如使用LabEx多因子检测,可快速定位,省却PCR扩增过程,直接反应样本的真实状态!

敲除 cGAS 和 STING

HeyA8 细胞在治疗后显示时间依赖性方式增加 STING 水平,STING 激活导致 IRF3 磷酸化,进而导致 I 型干扰素激活,IRF3 发生磷酸化后,会转移到细胞核并激活其靶基因的转录,例如 CXCL10、CCL3、CCL5 以及各种白细胞介素,因此,作者随后检测了 STING 激活下游的两个主要靶基因 CCL5 和 CXCL10 的 mRNA 表达。
结果显示cGAS 或 STING 的消耗未能诱导 CX-5461 介导的 CXCL10 和 IL-6 诱导。
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货号 检测因子
LX-MultiDTX-45 CCL2/JE/MCP-1,CCL3/MIP-1 alpha,CCL4/MIP-1 beta,CCL5/RANTES,CCL11/Eotaxin,CCL19/MIP-3 beta,CCL20/MIP-3 alpha,CD40 Ligand/TNFSF5,CX3CL1/Fractalkine,CXCL1/GRO alpha/KC/CINC-1,CXCL2/GRO beta/MIP-2/CINC-3,CXCL10/IP-10/CRG-2,EGF,FGF basic/FGF2/bFGF,Flt-3 Ligand/FLT3L,G-CSF,GM-CSF,Granzyme B,IFN-alpha 2/IFNA2,IFN-beta,IFN-gamma,IL-1 alpha/IL-1F1,IL-1 beta/IL-1F2,IL-1ra/IL-1F3,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8/CXCL8,IL-10,IL-12 p70,IL-13,IL-15,IL-17/IL-17A,IL-17E/IL-25,IL-33,PD-L1/B7-H1,PDGF-AA,PDGF-AB/BB,TGF-alpha,TNF-alpha,TRAIL/TNFSF10,VEGF
LX-MultiDTX-48 FGF-basic, Eotaxin, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IL-1β, IL-1rα, IL-1α, IL-2Rα, IL-3, IL-12(p40), IL-16, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, GRO-α, HGF, IFN-α2, LIF, MCP-3, IL-10, IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-17, IP-10, MCP-1(MCAF), MIG, β-NGF, SCF, SCGF-β, SDF-1α, MIP-1α, MIP-1β, PDGF-BB, RANTES, TNF-α, VEGF, CTACK, MIF, TRAIL, IL-18, M-CSF, TNF-β

体内疾病模型验证

将 COV362 或 HeyA8 细胞皮下 (SQ) 植入免疫功能低下的小鼠。通过口服强饲法用 CX-5461(50 mg/kg) 或 (Na 2 PO 4 pH-4.5)载体治疗小鼠。连续测量肿瘤并在 3 周后 Luminex 检查细胞因子谱。
分析显示 COV362 SQ 中 Eotaxin、CCL3、CXCL10 和 IL-1b 增加。与体外实验结果一致!

CX-5461 诱导细胞质 DNA 积累

CX-5461 处理显著诱导 DNA 损伤反应,导致 G2 期延迟,

结论

数据表明:
1、POL I 抑制剂 CX-5461 诱导细胞质 DNA 的大量积累,转录激活 STING,并诱导 IRF3 磷酸化,从而在卵巢癌细胞中诱导 I 型干扰素相关细胞因子的分泌:IL-6 和 CXCL10;
2、CX-5461 治疗降低了异种移植模型中的肿瘤负荷;

讨论

 CX-5461 诱导细胞溶质 DNA 的释放,其被 cGAS 识别,然后发生级联信号传导(图 5)。尽管最近显示了 cGAS-STING 通路在通过增强 I 型 IFN 产生决定抗肿瘤免疫中的重要性,但这项研究可能通过 cGAS-STING 通路提供对 CX-5461 介导的抗肿瘤活性的额外见解,这可以是与癌症治疗有关。

展望

    肿瘤及其药物治疗靶点的研究仍是肿瘤免疫研究领域的重点,生物标志物在细胞间相互作用对于肿瘤治疗的效果仍是研究的热点及难点!

详见LabEx网站( http://www.u-labex.com)或来电咨询!
基因水平:PCR Array
蛋白水平:MSD、Luminex、CBA、Antibody Array、ELISA
细胞水平:磁珠分选、流式细胞分析
组织水平:多重免疫组化、病理分析

联系电话:4008-168-068 转3
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