Elispot
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酶联免疫斑点技术(Elispot)
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随着酶免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用,使体外检测各种细胞因子和抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时,以往人们常用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测体液中游离的细胞因子(CK)或抗体,但由于游离的循环抗体或CK半衰期不同,使之在体液中不断地被代谢或与靶器官结合,而不能确切地反应体内抗体及CK水平。80年代中期等根据ELISA技术的基本原理,建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点(ELISPOT)技术,因其具有较高的特异性和敏感性,目前正被国内外广泛应用,对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
 产品特点:
酶联免疫斑点技术Elispot(Enzyme-linked Immunospot Assay)。结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术(ELISA),能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。
实验设计在96孔培养板上进行,直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质,包被上特异性的单克隆抗体,用以捕获细胞分泌的细胞因子。(由于涉及到细胞培养的过程,对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体,该抗体需要无毒,不含内毒素,亲和力高等特点。)之后,在培养板的孔内加入细胞培养基(现在无血清ELISPOT技术已经成熟,培养基中可以不再含有血清)、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。
 技术原理
在细胞受到刺激后局部产生CK,该CK被特异性的单克隆抗体捕获。洗去分泌细胞后,被捕获的CK与生物素(Biotin)标记的二抗结合,然后再与碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase AKP)或辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP)标记的链亲和素结合。经底物,如BCIP/NBT孵育后,在PVDF孔板出现有色的斑点即表明细胞产生了CK。通过显微镜或ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点进行分析即可获得结果。
与ELISA 基本相似,即通过生物酶高催化效率放大反应效果,进而达到很高的敏感度,便于检测微量的抗原或抗体。其实验设计是在96微孔培养板的底部披覆PVDF 薄膜,包被经特殊挑选的、无毒性(不含Sodium azide、内毒素Endotoxin)的单克隆抗体。然后洗脱未结合的单克隆抗体,封闭。随后将经适当分离处理后的细胞(如外周血单核细胞(Peripheral blood mononu2clear cell,PBMC))分配到微孔上,用适当的抗原刺激,并将96孔板放置于温箱中过夜培养一段时间。一般情况下,记忆型T细胞在受抗原刺激后数小时开始分泌C,此时局部(紧靠分泌细胞的周围)分泌出的CK会被PVDF薄膜上包被的特异性抗体捕获。洗去微孔中的细胞和未结合的组分之后,被捕获的CK进一步使用生物素标记的特异性检测抗体来标志。然后将未结合的酶洗除,再以AKP或HRP标记的链亲和素与之作用,并加入底物(如BCIP/NBT)使其呈色,有反应作用的细胞会留下大小染色的斑点。斑点多少可以在ELISPOT读数系统上进行自动化计数或在立体显微镜上进行人工计数。当然也可以在96微孔培养板上包被特异性捕获抗体来检测特异的CK分泌细胞。

 技术优势
(1) 单细胞水平,活细胞功能检测:弥补了体液中CK半衰期短的不足,当体液中某CK含量较低时,用ELISPOT 法检测具有较高灵敏性。
(2) 操作简便经济,可以进行高通量筛选:既可检测自发分泌细胞,又可检测抗原特异性CK分泌细胞,具有较高特异性,并可观察药物治疗反应,且首次使对CSF中T、B细胞研究成为可能,对神经免疫疾病发病机制研究及临床疗效观察均有重要价值。
(3)灵敏度高:在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。灵敏度比传统ELISA方法高2-3个数量级。
 应用领域

 结果展示

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