USP22 inhibition potentiates GPC3 chimeric antigen receptor macrophages efficacy in hepatocellular carcinoma by downregulating tumor CD24 expression

《USP22抑制通过下调肿瘤CD24表达增强GPC3嵌合抗原受体巨噬细胞在肝细胞癌中的疗效》

USP22,CD24,肝癌,巨噬细胞,GPC3嵌合抗原受体 LabEX支持文献

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期刊 CANCER LETTERS
分区 1区
时间 2026
影响因子 11.8
起止号 2026 Sep 1:655:218593.
种属 Human
技术平台 Luminex
应用领域免疫/内分泌
研究方向免疫/内分泌
疾病类型肝癌
检测蛋白 CCL11/Eotaxin,FGF-23,FGF basic/FGF2/bFGF,G-CSF,GM-CSF,Granzyme B,IL-10,IL-12/IL-23 p40,IL-12 p70,IL-13,IL-15,IL-16,IL-17/IL-17A,IL-18/IL-1F4,IL-1ra/IL-1F3,IL-2,IL-23,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8/CXCL8,CXCL10/IP-10/CRG-2,CXCL11/I-TAC,CCL2/JE/MCP-1,CCL7/MCP-3/MARC,CCL22/MDC,MIF,CD138/Syndecan-1,CD253/TRAIL/TNFSF10,VEGF,VEGF-R2/KDR/FLK1,Serpin E1/PAI-1,M-CSF,CCL27/CTACK,CCL25/TECK,CCL24/Eotaxin-2/MPIF-2,CCL1/I-309/TCA-3,CX3CL1/Fractalkine,CCL17/TARC,Insulin,VEGF-C,TIM-1/KIM-1/HAVCR,CD141/Thrombomodulin/BDCA-3,SOST/Sclerostin,SCF/c-kit Ligand/KITLG,Prolactin,Pentraxin 2/SAP,PDGF-BB,Osteoprotegerin/TNFRSF11B,Lipocalin-2/NGAL,LIGHT/TNFSF14,LIF,Leptin/OB,IL-33,IL-31,IL-21,IL-17E/IL-25,IL-11,Granzyme A,Follistatin-like 1/FSTL1,Flt-3 Ligand/FLT3L,Endothelin-1,EGF,Dkk-1,Cystatin C,CD40L/TNFSF5,CD31/PECAM-1,CCL5/RANTES,AgRP/ART,C-Peptide,BDNF,Adiponectin/Acrp30,TREM-1,Thrombopoietin/Tpo,Resistin,IL-17C,CXCL5/ENA-78,CD40/TNFRSF5,CD14,CCL8/MCP-2,CCL26/Eotaxin-3,CCL13/MCP-4,TFF3,PBEF/Visfatin,CXCL13/BLC/BCA-1,IL-19,Complement Factor D/CFD/Adipsin,XCL1/Lymphotactin,Vitamin D BP,Uromodulin,Serpin F1/PEDF,Renin,PlGF,Myeloperoxidase/MPO,MMP-10,IGFBP-4,HE4/WFDC2,FABP4/A-FABP,ErbB2/Her2,Carbonic Anhydrase IX/CA9,CA15-3/MUC-1,vWF-A2,VAP-1/AOC3,uPAR,ULBP-2/5/6,UCH-L1/PGP9.5,Troponin I/TnI,TRANCE/TNFSF11/RANK L,TRACP/PAP/ACP5,Total Inhibin,TNFRII/TNFRSF1B,TNFRI/TNFRSF1A,Thymidine Kinase 1,Thrombospondin-2,TfR/Transferrin R,TFPI,TACI/TNFRSF13B,Syndecan-4,Stanniocalcin 1/STC-1,SP-D,SLPI,Serpin B3/SCCA1,Serpin A7/TBG,Serpin A10/ZPI,SCGF/CLEC11a,S100A9,ROBO4,Reg3A,RAGE/AGER,CD62P/P-Selectin,Properdin,Procalcitonin,PD-L1/B7-H1,PDGF-DD,PDGF-CC,PDGF-AB,PDGF-AA,Park7/DJ-1,Oncostatin M/OSM,NT-4,NT-3,Neuregulin-1 beta 1/NRG1 beta 1,Nephrin,MSP/MST1,MMP-1,MFG-E8,M-CSF R/CD115,Lumican,CD62L/L-Selectin,Leptin R,Kallikrein 5,ITIH4,IL-1 RII,IL-1 RI,IGFBP-3,IGFBP-1,HTRA2/Omi,HMW Adiponectin/Acrp30,GDF-15,Galectin-3BP/MAC-2BP,Furin,Follistatin-related Gene Protein/FLRG,FGF-13,FasL/Fas-L/Fas Ligand/TNFSF6,ErbB3/Her3,EphA2,ENPP-2/Autotaxin,Endocan/ESM-1/Endocan-1,CD147/EMMPRIN,DR3/TNFRSF25,CD26/DPPIV,DcR3/TNFRSF6B,CXCL4/PF4,Cripto,C-Reactive Protein/CRP,Coagulation Factor III/Tissue Factor/TF,Chitinase 3-like 1/CHI3L1/YKL-40,CD23/FcεRII,CCL18/PARC,CCL15/MIP-1δ,Cathepsin S,Calbindin D,BMP-10,CD166/ALCAM,Aggrecan,Uteroglobin/SCGB1A1,TIMP-1,Serpin C1/Antithrombin-III,Proteinase 3/Myeloblastin/PRTN3,Progranulin/PGRN,Osteopontin/OPN,MMP-8,MMP-2,MMP-12,LRG1,IGFBP-7/IGFBP-rp1,IGFBP-6,HGF,CD105/Endoglin,CXCL16,CXCL14/BRAK,Contactin-1,CD117/c-kit,CCL28,CCL14/HCC-1/HCC-3,Angiopoietin-2/ANGPT2,ADAMTS13,TRAIL R3/TNFRSF10C,Tenascin C,SHBG,Serpin A4/Kallistatin,Relaxin-2,Periostin/OSF-2,Pentraxin 3/TSG-14,Osteoactivin/GPNMB,Neuropilin-1,CD146/MCAM,MAdCAM-1,LBP,Kallikrein 3/PSA,Growth Hormone,Fibronectin,FGF acidic/FGF1,EN-RAGE/S100A12,Enolase 2/Neuron-specific Enolase,CXCL7/NAP-2,Chemerin,CD66e/CEACAM-5,CD66a/CEACAM-1,CD163,CCL21/6Ckine,BMP-7,BMP-4,BCMA/TNFRSF17,APP,Angiogenin,Angiopoietin-1/ANGPT1,APRIL/TNFSF13,BAFF/BLyS/TNFSF13B,BMP-2,BMP-9,CA125/MUC16,CD27/TNFRSF7,CD30/TNFRSF8,CD44,D-Dimer,Endostatin,EpCAM/Ep-CAM/TROP1,CD62E/E-Selectin,CD95/Fas/TNFRSF6/APO,Ferritin,Fetuin A/AHSG,Galectin-3/GAL3,Galectin-9/GAL9,CXCL6/GCP-2,GDNF,GITR/TNFRSF18,gp130/sIL-6Rβ,HB-EGF,HGFR/c-MET,CD54/ICAM-1,IGFBP-2,IL-27,IL-3,ST2/IL-33R,IL-34,Kallikrein 6/Neurosin,Lactoferrin,PLA2G7/PAF-AH/Lp-PLA2,MBL,Mesothelin,MIA,MICA,Midkine,CXCL9/MIG,MMP-13,MMP-7,CCL23/MPIF-1,Myoglobin,N-Cadherin,CD56/NCAM-1,Nectin-4,Coagulation Factor XIV/Protein C,Protein S/PROS1,S100B,SPARC,Tie-2,TRAIL R2/TNFRSF10B,TSLP,ULBP-1,ULBP-3,ULBP-4/RAET1E,CD106/VCAM-1,VEGF-R1/FLT1,VEGF-R3/FLT4,4-1BB/TNFRSF9/CD137,alpha 2-Macroglobulin,alpha-N-acetylglucosaminidase/NAGLU,Aldehyde Dehydrogenase 1-A1/ALDH1A1,alpha 1-Microglobulin,alpha-Fetoprotein/AFP,Fibroblast Activation Protein alpha/FAP,beta-NGF,Angiopoietin-like Protein 3/ANGPTL3,Angiopoietin-like Protein 4/ANGPTL4,Angiopoietin-like Protein 6/ANGPTL6,Galectin-1,Atrial Natriuretic Peptide/ANP,beta 2-Microglobulin,B7-H3,Gas6,Pro-Collagen I alpha 1,Proprotein Convertase 9/PCSK9,IFN-alpha,IFN-beta,IFN-gamma,IFN-gamma R1/CD119,RBP4/Retinol-Binding Protein 4,CCL3/MIP-1 alpha,CCL4/MIP-1 beta,S100A8,IL-1 alpha/IL-1F1,IL-1 beta/IL-1F2,CCL19/MIP-3 beta,CCL20/MIP-3 alpha,Serpin A12,alpha-Synuclein,CD25/IL-2R alpha,Tau,IL-28A/IFN-lambda 2,IL-28B/IFN-lambda 3,TGF-alpha,Collagen IV alpha 1,IL-36 beta/IL-1F8,Complement Component C2,IL-4R alpha,Complement Component C5a,IL-6R alpha,Complement Component C9,TNF-alpha,CXCL1/GRO alpha/KC/CINC-1,CXCL2/GRO beta/MIP-2/CINC-3,Lymphotoxin-alpha/TNF-beta,u-Plasminogen Activator (uPA)/Urokinase,MMP-3,MMP-9
doi 10.1016/j.canlet.2026.218593.

Abstract

尽管基于免疫治疗的方案已改善了部分晚期肝细胞癌（HCC）患者的总生存期，但许多患者最终仍出现疾病进展。巨噬细胞在HCC微环境中大量存在，是具有前景的治疗效应细胞，然而将嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-M）与巨噬细胞检查点靶向相结合的潜力尚未得到充分探索。鉴于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的GPC3（glypican-3）在HCC中高表达，研究人员构建了靶向GPC3的CAR-M系统，并评估其单独使用以及与USP22抑制联合应用的疗效。USP22是一种去泛素化酶，此前已被证实与肿瘤CD24表达相关，本研究将其选为联合靶点以期解除CD24相关的吞噬抑制。体外实验表明，GPC3 CAR-M细胞对多种GPC3阳性HCC细胞系表现出特异性结合、吞噬能力和强效细胞毒性。²⁸RNA测序和流式细胞术揭示USP22与巨噬细胞检查点CD24之间存在统计学显著的正相关性。加入USP22抑制剂后，CAR-M的肿瘤杀伤能力呈剂量依赖性增强，且伴随肿瘤细胞表面CD24表达的降低。该联合策略在小鼠腹腔播散模型和患者来源异种移植（PDX）模型中均强力抑制了肿瘤生长。重要的是，该增效作用在THP-1来源、人单核细胞来源巨噬细胞（hMDMs）和人多能干细胞（hPSCs）来源的CAR-M细胞中均被观察到，凸显了其广泛的适用性。该研究为联合GPC3 CAR-M治疗与USP22抑制作为HCC潜在免疫治疗策略提供了临床前概念验证证据。

一、Luminex 实验完整操作步骤

1. 样本制备

细胞共培养分组
分两大体系：
- THP-1 来源：CAR-M-THP-1 / 空载体对照 VEC-M-THP-1，分别与 Hep3B 肝癌细胞共培养；设置加 USP22 抑制剂（USP22i）、不加抑制剂两组；
- hPSC 干细胞来源：CAR-M-hPSC / VEC-hPSC-M，与 Hep3B 共培养，同样 ±USP22i。
孵育时长：共培养 48 h。
上清收集：吸取培养上清，离心去除细胞碎片，分装后 - 80℃冻存备用。

2. 同时检测的细胞因子面板

促炎因子：IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ

抑炎因子：IL-10

二、实验核心验证目的

总机制：证明 USP22 抑制剂可重塑 CAR-M 巨噬细胞分泌谱，推动 M1 促炎极化

单独 CAR-M vs 对照巨噬细胞：CAR-M 本身就能上调促炎因子（TNF-α/IL-1β/IL-6）、下调抑炎 IL-10，说明 CAR 靶向结合肿瘤细胞会激活巨噬细胞促炎表型；
±USP22 抑制剂对比：加入 USP22i 后，无论普通巨噬细胞还是 CAR-M，促炎因子分泌进一步显著升高，抑炎因子 IL-10 进一步降低；
机制佐证：联合转录组、WB 实验证明该极化效应依赖NF-κB 信号通路；
跨模型验证：在 THP-1 细胞系、hPSC 干细胞两种巨噬细胞来源中重复相同结论，证明效应普适。

三、对应数据图（分两大模块）

模块 1：THP-1 巨噬细胞 Luminex 结果 → Figure 4 H、I

图4 Luminex细胞因子定量

图 4H：VEC-M（空载体巨噬）±USP22i 上清细胞因子浓度；
结果：USP22i 单独处理普通巨噬，即可升高 IL-1β、IL-6、TNF-α，降低 IL-10；
图 4I：CAR-M-THP-1 ±USP22i 上清细胞因子浓度；
结果：CAR-M 基础促炎分泌更高；叠加 USP22i 后促炎因子进一步大幅上升，抑炎因子持续下降。

模块 2：hPSC 干细胞来源 CAR-M Luminex 结果 → Figure 7 G、H、I

图7 hPSC-CAR-M细胞因子检测

图 7G/H/I：对比 VEC-hPSC-M 与 CAR-hPSC-M 共培养上清 TNF-α、IL-1β、IL-6；
结果：hPSC-CAR-M 天然分泌更多促炎因子，与 THP-1 体系结论一致，证明该表型不依赖永生化 THP-1 细胞，干细胞来源临床级 CAR-M 同样适用。

四、关键结论汇总

CAR 靶向 GPC3 结合肝癌细胞本身就能诱导巨噬细胞 M1 促炎极化；
USP22 抑制剂可进一步放大促炎因子释放、抑制免疫抑制因子分泌；
该现象在 THP-1、人干细胞 hPSC 两种 CAR-M 制备体系完全重复，支撑 “USP22i 联合 CAR-M” 的临床转化价值；
Luminex 分泌谱结果和 RNA-seq 转录富集（TNF/NF-κB 通路）、NF-κB 挽救 WB 实验形成完整机制证据链。

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