Western blot(蛋白质印迹法)简介及实验注意事项异常分析
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   Western blot简介 蛋白质印记又称免疫印记,根据抗原抗体的特异性结合检测样品中的某种蛋白的方法。它是利用特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色,通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

 

 

   Western blot的原理 Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

 

   以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。


 

 

Western blot实验服务


 ⑴ LabEx公司提供内参

   我实验室进行实验服务免费提供内参,意味着实验者不必要花更多的钱去购买内参实验。

 

 ⑵ LabEx免费提供二抗以及所有的与实验相关的后续试剂

 

 ⑶ 实验委托者只需要提供样本和一抗,即可完成整个实验


 


关于Western blot实验异常分析


『无信号』

原因 建议
一抗与二抗不匹配 选择针对一抗来源种属制备的二抗;
一抗不识别目的的种属的蛋白

1)检查抗体的说明书,适用范围内是否包含目的种属
2)使用阳性对照来检查抗体质量

一抗或二抗不足,没有足够的抗体结合到目的蛋白

1)降低抗体稀释倍数,增加抗体浓度
2)延长孵育时间

封闭剂与一抗有交叉反应 改变封闭剂
抗原不足

1)每个泳道加入20-30ug总蛋白
2)制备样品要使用蛋白酶抑制物及使用阳性对照

在检测的组织内目的蛋白表达水平低 检测样本不表达目的蛋白选择表达量高的细胞作为阳性对照,用于确定检测样本是否为阴性,也可更换细胞系
蛋白转膜效率低

1)利用丽春红检测转膜效率;检查转移装置是否电极弄反
2)转移前膜是否用甲醇侵泡过

膜过渡洗涤 减少洗涤时间和强度
叠氮钠抑制二抗活性 二抗稀释液内不用叠氮钠

 

『没有特异条带

原因 建议
细胞系传代过多后蛋白表达谱发送变化 1)使用未传代或传代次数较少的细胞系进行样品制备
蛋白本身有很多修饰 1)查阅文献,确定目的蛋白是否存在多种修饰
蛋白被消化或者降解 1)蛋白样品确保未被污染,确保含有蛋白酶抑制剂
所检测蛋白存在多种剪接体,导致分子量大小不同 1)查阅文献或者通过搜索数据库来确定该蛋白是否存在多种长度不同的编码mRNA
一抗或二抗浓度高 1)减低抗体浓度
洗涤不够 1)充分洗涤

 

『条带大小不正确』

原因 建议
目的蛋白被降解 确保蛋白样品未被污染,确保含有蛋白酶抑制剂
存在不同的剪接体 查阅文献或者通过搜索数据库来确定该蛋白是否存在多种长度不同的编码mRNA
重组蛋白 检测是否存在额外加入的蛋白
特殊蛋白如MDM2等 仔细阅读抗体说明书

 

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