BD Rhapsody单细胞多组学技术， 可同时实现单细胞的转录组 + 蛋白组 + VDJ分析 + 混样技术。 在即将分享的Nature工作中 作者充分利用BD的多组学优势，开创性的发现了肿瘤特异T细胞并鉴定了其生物标志物，为未来肿瘤靶向治疗提供可能.

此外，该工作大量使用BD流式分析技术及BD Rhapsody单细胞多组学技术，实验结果互相验证，相辅相成;单细胞RNA 测序样本，全部利用BD流式分选技术进行样本富集，提升单细胞数据分析精度，同时节约测序成本。 BD流式技术与 BD Rhapsody单细胞多组学技术珠联璧合，为单细胞研究提供多维度的解决方案，欢迎广大科研临床及工业用户试用!

今天要和大家分享的文章，是近期发表于Nature期刊的“Extricating human tumour immune alterations from tissue inflammation”，该工作系统性的分析了头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)及部位匹配的非恶性炎症口腔粘膜(OM)的免疫 特征，发现了一群肿瘤特异的T.亚群，具有显著的免疫抑制，可应答TCR信号，且可活跃增殖，并创新性的鉴定了其生物 标志物，为肿瘤精准治疗提供新的思路。

免疫疗法在癌症治疗方面取得了显著的成功，但仍然存在挑战。其中一个显著弱点就是，治疗所靶向的通路并不局限 于肿瘤，在其他组织微环境中也存在。尽管很多工作聚焦在肿瘤微环境的炎症反应，但是我们对肿瘤特异的免疫变化还知 之甚少。

单细胞RNA测序技术:

流式分析OM及HNSCC及外周血的免疫表型:

肿瘤组织中，功能衰竭的T细胞和T细胞，通常被认为是抗肿瘤免疫反应无效的关键。另外，T细胞的效应功能与APCS (Antigen Presenting Cells )切相关。作者通过2组30参数的高维流pane深度分析了OM和HNSCC组织及血液中的上述免疫 细胞图谱。结果发现在OM和HNSCC组织的免疫表型基本相似:CD45⁺ Lie细胞中CD3⁺ T细胞，CD19⁺ B细胞以及CD56⁺ NK细胞 的比例以及CD4/CD8 ratio基本一致 (Fig 1A)。APC细胞方面，DC2s，DC3及CD16⁺ 非常规单核细胞的比例在OM及HNSCC组 织中基本一致，CD141 ⁺ CDC1s比例在HNSCC肿瘤组织中的略低(Fig 1B)。

为了鉴定特定的免疫亚群的差别，作者利用了FAUST，一种以无监督的方式发现和注释统计上相关的细胞表型的机器算 法。结果发现，T细胞panel中，HNSCC中富集一个CD8⁺ T和4个CD4⁺ Treg 亚群;APC细胞panel中，HNSCC中富集CD40及PD-L 共表达的CD14⁺ 细胞及CDC2s，DC3细胞。

为了进一步研究上述免疫细胞的一致性及区别，作者利用了单细胞RNA测序技术，发现了与上述流式结果相一致的免 疫表型，并鉴定了肿瘤特异的转录特征。之后通过NicheNet方法研究了肿瘤特异性的T细胞和APC细胞通讯。发现HNSCC肿 瘤T-APC细胞通讯富集的配体受体相互作用如下:ICOS配体via COS,L-18 via L18-R1以及IL1B via L-1受体1型及2型

由于流式及scRAN-seq都显示HNSCC肿瘤T细胞的差异，接下来作者进一步验证TAPC的相互作用。通过流式分析发 现IL1R1(富集于T细胞与APC通讯)特异性的表达在肿瘤浸润的T,细胞上(Figure 2A)。几乎所有的IL1R1T细胞共表达 ICOS，IL-18R1以及趋化因子受体CXCR6 (Figure 2B)。

为了进一步区分肿瘤浸润的IL1R1⁺ T_reg及IL1R1^- T_reg细胞的区别，作者分选了OM、HNSCC以及外周中的T_reg细胞，利 用了BD Rhapsody免疫响应基因pane的单细胞RNA测序，发现肿瘤L1R1^- T_reg。(Figure 3A)，橙色亚群及IL1R1·Tg( Figure 3A，蓝色亚群)细胞形成了独立的亚群，区别于外周血T_reg细胞。在L1R1⁺ T_reg。细胞中，选择性的富集了≥50个转录本 (Figure 3B )，包括TNFRSF18(编码GITR)和TNFRSF9(编码4-1BB) 提示IL1R1⁺ T_reg细胞代表肿瘤浸润T_reg细胞中一群 转录组特异的免疫亚群。

在CD8⁺ T细胞及CD4⁺ T细胞的体外增殖抑制实验中，IL1R1⁺ T_reg细胞比IL1R1^- T_reg细胞具有更有效的抑制效果( Figure 4A)。另外，通过anti-CD3,anti-CD28 and anti-CD2 磁珠刺激，肿瘤浸润IL1R1⁺ T_reg中L1R1的表达在第1天升高，第2-3天下 降( Figure 4B)，提示IL1R1⁺ T_reg细胞应答TCR信号并产生IL1R1的表达。

Figure 4. IL1R1⁺T_reg细胞功能研究

为了进一步研究肿瘤浸润IL1R1⁺ T_reg细胞应答激活信号的免疫反应，作者利用PMA及离子霉素短时间刺激，然后利用BD Rhapsody单细胞转录组联合Abseq膜蛋白测序，系统性的分析了这类细胞的转录组、蛋白组变化。对CD4⁺ T细胞及T_reg细胞进 行无监督聚类分析，显示3个T亚群:IL1R1 ⁺ ，IL1R1^- 及活跃增值的IL1R1⁺ T_reg细胞。PMA及离子霉素刺激后，T_reg细胞差异表达重白及差异表达基因见Fgure 5A-B，例如高表达TNFRSF9 及CTLA4 转录本，并显着高表达CTLA4蛋白，提示IL1R1⁺ T_reg细胞是激活并具有功能，且有一个活跃增殖的亚群。

Figure 5.BD Rhapsody单细胞多组学分析T_reg 细胞激活应答免疫反应

通过Abseq单细胞膜蛋白结果，作者鉴定出了一组生物标记物来唯一地识别IL1R1⁺ T_reg细胞。仅用2个膜表面蛋白就可以 特征的从组织和外周血所有CD45 ⁺ 的免疫细胞中标记这类细胞，并通过流式分析验证了标志物的特异性:几乎所有的 CD45 ⁺ IL1R1⁺ ICOS⁺ 细胞都是T_reg细胞( Figure 6A )，为未来向肿瘤特异性.细胞的治疗提供新的思路。

Figure 6. 发现并验证肿瘤特异T_reg的生物标志物

最后作者通过实验验证及公开的sRNA seq数据集(19种不同的肿瘤类型)分析发现，IL1R1⁺ T_reg细胞并不是特异性的存 在于HNSCC肿瘤，而是不同比例的分布于不同的实体肿瘤中。清除肿瘤浸润性T _reg细胞被认为是一种有前景的抗肿瘤治疗 该工作为靶向肿瘤特异T _reg而不影响其他T_reg免疫调节功能提供了可能。