Unstable regulatory T cells, enriched for naive and Nrp1 ^neg cells, are purged after fate challenge

研究者在本文中通过构建遗传诱导命运图谱小鼠技术(图1A)验证ex-Foxp3的产生(图1B)，在微生物/抗原 暴露下，无特定病原体的小鼠(SPF)与野生型小鼠(Cohouse)体内都会产生数量相近、性能一致的ex-Foxp3 细胞(图1C)。

通过遗传诱导命运图谱小鼠过继转移模型验证，发现ex-Foxp3细胞是Treg中的一群unstableTreg亚群(图2ABD 会在免疫缺陷的状态下转化生成(图2F)。

进一步通过体外Treg极化条件下培养exFoxp3细胞(图3A，B)、以及通过改进的遗传诱导命运图谱小鼠过继转移模型 进行体内验证(图3CF)，发现该ex-Foxp3细胞会持续保持炎症效应，而对Treg表达的谱系再无命运记忆(图3》。

BDRhapsody单细跑多组学技术:TTA(214)Abseq(5)+SMK

即使损伤改善后、炎症环境消除，ex-Foxp3细胞炎症状态也会持续存在，所以能表征出这个原始异质性的Treg亚群很重要。

基于流式技术获取的动力学数据，研究者评估了Foxp3缺失前Tegs基因表达的变化,选取regs(未处理的Foxp3^YFP-Cre Rosa^RFP 命运图谱小鼠中获取的CD4^- YFP⁺ RFP⁺ 细胞)和将Foxp3^YFP-Cre Rosa^RFP Tregs和同源naive T细胞共转移到Rag1^KO (免疫缺陷型)小鼠 体内后在第5,10和 15天获取 CD4⁺ YFP^- RFP⁺ ex-Foxp3细胞(图4A和图S10A)。降维聚类(UMAP)分析产生6个细胞亚群(图4B)。 Foxp3基因在所有ex-Fop3细胞群体中均无表达，与分选报告相对应(图4C)。依据不同时间点样本进行差异表达分析，发现 了三大类基因:快速丢失基因(Teg相关marker) 瞬时富集基因（稳定性丧失中起主要作用的基因）和后期富集基因(高度激活的表型相关基因)(图4D)。

为了深入了解不稳定Treg亚群的起源，研究者进行了基于Pearson相关关系的网络分析(r 0.95)，以识别第0天与第5天 ex-Foxp3细胞最相似的Treg(图4F)。Inter Treg被确定为富含Unstable Treg的候选亚群该亚群表达了88%的Treg特征基因因 此InterTreg群体仍然代表真正的Treg。

Inter Treg富集了naive Nrp1^- Treg(图4G)，流式细胞仪显示类似，牌nae细胞富含Nrp1^- Treg (图4H)。 在22%的第0天Treg 中检测到Nrp1的表达( 依据共表达基因为基础，可推断出占群体的89% )，只有13%的Inter Treg细胞和7%的第5天ex-Foxp3 细胞中检测到Nrp1(图4)。然而在inter reg亚群中分为Nrp1⁺ 和Nrp1^neg 两组,Nrp1⁺ 和Nrp1^- 细胞与第5天ex-Foxp3细胞的关 联性都很高，而与第10天ex-Foxp3细胞的关联性很少(图4I右图)。第5天ex-Foxp3细胞表达高水平CD62L(图4E)。在所有 Inter Treg差异表达的基因Nrp1在CD62L部分中特异下调。总之，这些数据提出了一个假设，nive Nrp1^- Treg是异质性Treg 细胞群中存在的亚群， 在淋巴细胞降低的环境下最容易转化。

Nrp1表达缺失被认为是外周诱导的Tregs pTregs)富集的原因。通过BAC-Foxp3^Cre-GFP 改进的遗传诱导命运图谱小鼠过继转移 模型将Treg亚群作为一个整体进行流式分选BAC(GFP) ⁺ Foxp3(Thy1.1)⁺ 亚群tTregs胸腺来源型Tregs);BAC(GFP)^- Foxp3 (Thy1.1)⁺ 亚群pTregs外周诱导型Tregs)(图5B)。验证发现与tTregs相比，pregs中富含unstable Treg(图5C)。活化状态 不影响Nrp1^- Treg的不稳定性(图5E)。但从ex-Foxp3细胞群形成的绝对数量来看，这两个Treg来源的ex-Foxp3百分比几乎贡 献值同等(图SF)并且tTreg部分的不稳定性可能主要源于早期和不完全确立的新近胸腺输出细胞(RTET)Treg(图5D)。