发表在 Cancer Cell 期刊的 “Neoantigen -specifc CD4T cells in human melanoma have diverse diferentiation states and correlate with CD8+Tcel,macrophage,and Bce function”，该研究系统性的分析了漫润黑色素瘤的肿瘤抗原特异性CD4⁺ T细胞 亚群的转录组特征，并分析其与患者存活率以及肿瘤微环境中其他免疫细胞功能的相关性。研究结果发现，黑色素瘤特异性的CD4 ⁺ T细胞基本均为CXCL13⁺ ，并且这群细胞与患者存活率，CD8⁺ T细胞、巨细胞和B细胞的功能呈正相关。

临床上，免疫检查点抑制剂的部分疗效由肿瘤抗原特异性T细胞所介导。目前，针对肿瘤抗原特异性T细胞的临床研究 大部分聚焦于细胞杀伤性CD8 ⁺ T的抗原特异性以及转录状态，而对肿瘤微环境中肿瘤抗原特异性CD4⁺ T细胞的表型、异质性 和功能等知之甚少。

作者采用不同的方法从2例黑色素瘤患者的组织(X205，X422)以及2例经过自体TIL回输治疗患者(X197,X198)的外 周血中分离出抗原特异性CD4⁺ T细胞

最后通过TCRVb测序鉴定上述方法收集到的抗原特异性CD4⁺ T细胞的TCR克隆型(11)，获得的这些抗原特异性TCR克隆 型的序列，将与后续单细胞实验的TCR克隆型序列进行比对。

采用流式分选和BD单细跑多组学技术对4例患者的黑色素瘤组织来源的CD3⁺ CD4⁺ T细胞进行靶向转录组和免疫组库分析。无监督聚类分析UMAP将捕获到的10184个细胞分成3个细胞亚群(6个Clusters)( 2A,2B,2C)，其中FxP3Treg细胞亚 群包含Ciuster0; CXCL13 ⁺ PD-1⁺ Tconv细胞亚群包含uster2,3,5;CXCL13^- IL7R⁺ Tconv细胞亚群包含Custer1，4。

随后，将已知抗原特异性的TCR克隆型序列(来自结果1)与单细胞实验测得的TCR克隆型序列进行比对，从而确定单细胞实验中抗原特异性TCR克隆型的分布。在本次单细胞实验中，针对肿瘤抗原的40个TCR克隆型共测得259个细胞(2D)。 随后将上述测得的细胞映射到UMAP图中，发现97%的肿瘤抗原特异性CD4⁺ T细胞都位于CXCL13⁺ PD-1⁺ Tconv细胞亚群中(2E,2F)且存在扩增的情况(2G)。综上可认为黑色素瘤抗原特异性CD4T细胞的表型为CXCL13⁺ 。

基于4例黑色素瘤样本的单细胞多组学结果将黑色素瘤抗原特异性的CD4T细胞亚群分为3个Clusters，Cluster2: CXCL13 ⁺ TCF7^- CXCR5⁺ (AbSeq); Cluster 3: CXCL13⁺ TCF7^- Tim3⁺ (AbSeg)以及Cluster 5: CXCL13⁺ TCF^- TYMS⁺ (2A,2B,2C)。

为验证以上的发现，同样采用流式分选和单细胞多组学技术，将研究队列从4例充到20例。以CD4⁺ (AbSeq)为筛选指 标，过滤出26773个CD4 ⁺ T细胞后，无监督聚类分析UMAP将这些CD4⁺ T细胞分为5个Custers，其中表达肿瘤抗原特异性markei CXCL13的3个Gusers分别为CXCL13 ⁺ TCF7⁺ 、CXCL13⁺ TCF7^- Tim3⁺ 、CXCL13⁺ TCF^- TYMS⁺ (3A,3B,3C)，该结果与前面小队列 研究的发现一致。

20例患者黑色素瘤样本以CXCL13⁺ CD4⁺ T细胞/CD4⁺T比值是否高于中位数，将其分为above median和below median两组 比较两组生存率发现above median的存活率比below medlan高(3E)。且通过TCGA数据库( 471例黑色素痛的Bulk RNASeq 数据)验证了以上发现(3F)。

以CD8⁺ (AbSeq，蛋白表达)为筛选指标，过滤出15332个D8T细胞后，无监督聚类分析UMAP将细胞分为4个Clusters 与肿瘤浸润CD4 ⁺ T细胞相类似，肿瘤浸润CD8⁺ T细胞大部分表达PD-1(A)，CD103(A)，D39(A)部分表达CXCL13(4C) 且在CXCL13 ⁺ 的细胞中，也存在CXCL13⁺ TYMS⁺ 和CXCL13⁺ TCF⁺ 的亚群(4C, 4D)，与肿瘤特异性CD4⁺ T细胞的亚群较为相 似。最后比较了肿瘤浸润CD4 ⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞这些相似亚群基因表达的相似度，结果发现两者各亚群的基因表达存在 定相似性。(4E)

有研究表明在肿瘤微环境中，CD4⁺ T细胞可调节其他免疫细胞的功能，因此作者在本研究中验证了CXCL13⁺ CD4⁺ T细胞 与CD8T细胞功能的相关性结果发现CXCL13 ⁺ CD4⁺ T细胞与CD8⁺ T细胞不同表型的亚群(表达活化相关的Markers)都存在正 相关(4F)。为进一步验证以上的发现，同样通过TCGA数据库(471例黑色素瘤的Bulk RNA-Seq数据)，分析XCL13⁺ CD4⁺ T 细胞亚群"代理基因"CXCL13/BTLA/L21与CD8A的相关性，结果证实两者确实存在一定程度的正相关(4G,4H)

同样的研究方法，发现肿瘤微环境中CXCL13⁺CD4⁺T细胞与巨噬细胞和B细胞的活化相关。最后，作者在乳腺癌队列中也得出了相似的结果，即经免疫检查点抑制剂治疗的乳腺癌患者其肿瘤浸润CD4⁺T细胞表现出相似的表型，且与CD8⁺T细胞 和髓系细胞的活化相关。

在本研究中，作者充分利用流式联合BD Rhapsody单细胞多组学技术优势对肿瘤抗原特异性CD4⁺ T细胞进行研究，结果 发现CXCL13 ⁺ 的肿瘤抗原特异性CD4⁺ T细胞与患者存活率和其他免疫细胞功能存在一定程度的正相关。该方法为后续其他肿瘤 抗原特异性CD4 ⁺ T细胞研究、肿瘤治疗疗效研究等提供了重要的研究思路。