二：BCR多种分析

文章基于 B 细胞受体（BCR）进行了多方面分析，旨在探究胃印戒细胞癌（GSRCC）中 B 细胞介导的免疫反应情况。 

B 细胞克隆分析

对 44,787 个 B 细胞进行聚类分析，并通过 scRepertoire 分析 BCR 测序结果。发现扩增的克隆型主要集中在浆细胞（PCs），尤其是 IgG 和 IgA 类，这类细胞负责体液免疫。且 GSRCC 中扩增的 B 细胞克隆型比非 GSRCC 中少，在非 GSRCC 中，扩增的浆 B 细胞以 IgG（主要是 IgG1）为主，而在 GSRCC 中，IgA - PC 和 IgG - PC 均未能有效扩增。已知胃肠道黏膜中 IgA 的富集在生理上有助于维持共生菌的稳态，并保护上皮细胞免受攻击 。IgG 的含量比 IgA 少，它通过应对感染来增强黏膜稳态，且主要的促炎亚类是 IgG1。

免疫球蛋白类别转换分析

通过对免疫球蛋白类别的比较，并结合 B 细胞的功能状态，分析 B 细胞轨迹中的类别转换情况。结果显示，与非 GSRCC 不同，GSRCC 中大量记忆 B 细胞无法发育为 IgG - PC 或 IgA - PC，呈现出免疫反应不佳的态势 。

体细胞高频突变（SHM）分析

分析 BCR 测序数据，将 B 细胞分为无 SHM、低 SHM 和高 SHM 三组。发现高 SHM 组主要存在于 PCs 的 BCR 中，其次是记忆 B 细胞。GSRCC 中发生 SHM 的 B 细胞比非 GSRCC 少，这意味着 GSRCC 中 B 细胞的抗原特异性启动减弱。

BCR 共享分析

研究不同样本中 B 细胞的 BCR 共享情况。正常情况下，IgA - PC 的 BCR 重叠最大，且与 IgG - PC 有共同起源。但在非 GSRCC 中，记忆 B 细胞更倾向于极化为 IgG - PC，导致 IgA - PC 和 IgG - PC 之间的同源性显著降低。在 GSRCC 中，IgM⁺记忆 B 细胞和 IgG - PC 之间的 BCR 重叠显著，与非 GSRCC 中的情况不同，这反映出 GSRCC 中 IgG 的来源异常，进而导致其功能异常。

总的来说，基于TCR/BCR分析，文章全面地揭示了胃癌免疫微环境的特征和机制，全面展现了胃癌免疫微环境的复杂性和异质性。

图2：胃癌中B细胞的聚类分析及 B 细胞受体（BCR）分析

接下来分享的是一篇发表于《Cancer Discovery》的《Glioblastoma-Infiltrating CD8+ T Cells Are Predominantly a Clonally Expanded GZMK+ Effector Population》。

研究通过对高级别胶质瘤（包含胶质母细胞瘤 GBM 和 4 级 IDH 突变星形细胞瘤 G4A ）患者的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）和匹配外周血单个核细胞（PBMC）进行 CITE-seq、scRNA-seq 及配对 V (D) J 测序等多种技术分析，发现 GBM 的 TIL 具有多种细胞状态且缺乏经典的耗竭表型；其中 CD8+ TIL 中 GZMK+ T 细胞占比较大，且可能与 TEMRA 细胞分别发育，其高表达 GZMK 和 GZMH 但经典细胞毒性标记物低表达 ；这种 GZMK+ T 细胞不仅在原发性和继发性脑癌中富集，在多种其他癌症类型的 TIL 中也存在；肿瘤微环境中的 GZMK+ T 细胞发生克隆性扩增且具有肿瘤特异性；GBM 患者的 GZMK+ TIL 在体外常规培养条件下扩增潜力有限，培养后的 TCR 克隆型不能代表初始状态。这些发现为理解 GBM 中 T 细胞群体特征提供依据，对探究其抗原特异性及调节该细胞群体以增强在脑肿瘤患者中的效应功能具有重要意义。

TCR分析

通过对免疫组 TCR 进行分析，探究胶质母细胞瘤（GBM）及其他癌症中 T 细胞的克隆型多样性、扩增状态以及它们与肿瘤微环境的关系。

1：分析不同 T 细胞状态下的 TCR 克隆型多样性与扩增状态：对 18,650 个 CD8+ T 细胞进行单细胞 V (D) J 测序，发现 60.9% 的细胞含有配对的 αβ TCRs。研究定义了 T 细胞的扩增状态，如 TCRs 计数为 1 的是单克隆，大于 2 且小于等于 50 为扩增等 。结果显示，TN 细胞大多是单克隆，而约 50% 的 NR4A2lo GZMK+、NR4A2hi GZMK + 和细胞毒性 TRM 簇以及高达 75% 的 TEMRA 簇细胞处于扩增或高扩增状态（下图A、B）。

2：对比不同样本类型中克隆型扩增的 TCR 相关 T 细胞状态：调查每种样本类型中前 50 个克隆型扩增的 TCR 相关的 T 细胞状态，发现 PBMC 和 HGG 样本中，前 3 个扩增的 TCR 中有 2 个是不变的 MAIT TCRs。在 PBMC 中，TEMRA 是与扩增 TCR 相关的最常见非 MAIT T 细胞状态；在 HGG TIL 中，GZMK+ T 细胞占克隆型扩增 T 细胞的大多数 ，且与 PBMC 中的相应群体相比显著富集；在 BrMet 样本中，细胞毒性 TRM 在克隆型扩增 T 细胞中占比最大，其次是 NR4A2lo 和 NR4A2hi GZMK+ T 细胞。这些结果表明，在脑肿瘤微环境中，与其他 T 细胞亚群相比，更多 GZMK+ T 细胞与扩增的 TCR 相关，且这些富集的克隆型由 NR4A2hi 和 NR4A2lo GZMK+ T 细胞共享，支持了 NR4A2hi GZMK+ T 细胞可能由 NR4A2lo GZMK+ T 细胞发育而来的假设（下图C）。

3：探究 GZMK+ TEff 中扩增的TCR与其他T细胞状态的关系：对两名患者的自体匹配 PBMC 和 TIL 进行成对分析，观察与GZMK+ TEff 相关的前10个扩增的非MAIT TCRs 的克隆型计数、分布和相关 T 细胞状态。结果显示，在 GBM106 样本中，与GZMK⁺ T 细胞状态相关的扩增TCRs在TIL 中的检测频率远高于 PBMC，且主要与 NR4A2^lo 或 NR4A2hi GZMK⁺ T 细胞状态相关；在 G4A112_Re 样本中，虽然 PBMC 中与 GZMK+ T 细胞状态相关的扩增 TCRs 频率较高，但主要与 TEMRA 状态相关，而在 TIL 中这些 TCRs 主要与 NR4A2^lo GZMK⁺ T细胞状态相关，且TIL中未检测到TEMRA和GZMK⁺ T 细胞共享特定 TCR 的表达。总体上，GZMK⁺ TCRs在TIL中选择性扩增，与PBMC的克隆型重叠度低，支持了细胞毒性 TRM和NR4A2^lo/hi GZMK⁺ T 细胞在肿瘤微环境中处于相同发育轨迹的观点（下图D、E）。

4：分析不同癌症类型中 GZMK⁺ T 细胞的 TCR 扩增状态：在整合的肿瘤数据集里，研究 20 种肿瘤类型中 GZMK+ T 细胞的 TCR 扩增状态，发现其中 13 种肿瘤类型的 V (D) J 数据可用于量化扩增状态。结果显示，在整合肿瘤数据集中，NR4A2^lo 和 NR4A2^hi GZMK⁺ T 细胞均处于扩增状态，超过 60% 的细胞为扩增或高扩增状态。这表明扩增的 GZMK⁺ TCRs 在肿瘤环境中特异性扩增，且这种扩增不仅存在于脑肿瘤，还发生在多种不同解剖部位的癌症类型中（下图F）。

图3：扩增的 GZMK+ T 细胞在高级别胶质瘤（HGG）的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中富集，且具有肿瘤部位特异性，在匹配的外周血中则不存在。

结语

从上述两篇文章对免疫组的应用可知，免疫组的应用范围极为广泛。在细胞研究方面，它能为探究细胞的发育轨迹与来源提供有力证据，帮助科研人员清晰梳理细胞的演变历程。同时，免疫组还能独立开展样本间的克隆和亚型分析，精准识别样本差异，挖掘细胞特性，为多领域研究筑牢基础。乐备实在单细胞多组学研究中具有丰富的经验，欢迎各位老师同学与我们联系合作。

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