在生物医学研究和临床诊断中，细胞因子作为关键的生物分子，其浓度和活性的变化直接关联着多种生理和病理过程。乐备实提供的一站式多重细胞因子免疫分析平台，旨在为研究人员和医疗专业人员提供一个从样本处理到数据分析的全面解决方案，以深入探索细胞因子的奥秘。
细胞因子的重要性: 细胞因子是一类分子量在6-70 kDa之间的小分子蛋白（肽），包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子等。它们在细胞信号传导、细胞间通讯及免疫功能中扮演着关键角色。细胞因子不仅参与炎症反应的调节，还涉及细胞生长与分化、趋化及促血管生成等过程。因此，细胞因子的精确检测对于理解疾病机制和评估治疗效果至关重要。
细胞因子的调控与检测: 细胞因子的产生和活性受到严格的调控。在健康状态下，它们在体液中的浓度较低，而在炎症或疾病状态下，细胞因子浓度的升高可能指示相关信号通路的激活。因此，细胞因子常被用作生物标志物，用于监测疾病进展和治疗效果。乐备实平台提供的检测技术能够准确测量这些关键分子，为疾病研究和临床应用提供重要数据。
单/多因子检测平台
乐备实平台提供了一系列先进的细胞因子检测技术服务，包括单指标和多指标检测，以及单细胞水平的细胞因子检测。这些技术包括：
单指标检测：酶联免疫吸附测定（ELISA），这是一种经典的技术，用于精确测定单一细胞因子的浓度。
多指标检测：包括Meso Scale Discovery（MSD）、液相悬浮芯片Luminex、Cytometric Bead Array（CBA）和抗体芯片，只需最低25ul样本，能够单孔同时检测高达115个细胞因子，提供更全面的分析。
单细胞水平细胞因子检测：酶联免疫斑点法（ELISpot）和流式细胞术，能够检测单个细胞产生的细胞因子，为研究细胞水平的免疫反应提供重要信息。
单指标检测技术
酶联免疫吸附试验(ELISA)
ELISA是基础和临床研究中对单一分析物进行定量分析的重要技术，可广泛用于多个物种和靶标的检测。目前商用的细胞因子ELISA试剂盒大多采用双抗体夹心法，能够高特异性检测复杂样品中的分析物，灵敏度高，操作简单方便，成本相对较低。但ELISA一次实验仅能检测一个靶标，若需在同一样品中检测多个靶标，操作多个ELISA较为复杂，时间花费长，且需要的样本量较大，后面提到的多指标分析技术可克服这些问题。另外，ELISA较窄的动态范围，使得部分样本需要稀释，这样可能会夸大样本间的差异。
❖检测仪器平台：酶标仪
❖反应容器：96或384孔板
❖可检测种属：人、小鼠、大鼠、非人灵长类、猪、狗、牛、羊等多个种属
❖可检测样本类型：血清、血浆、细胞培养上清等，不同的试剂盒适配的样本类型不同。
❖所需样本体积：50-100 µL
❖单次实验可检测指标数：1
❖灵敏度：pg/ml
❖检测仪器平台：酶标仪
❖线性范围：2-3 logs，常规ELISA线性范围在10pg/ml-1000pg/ml，超敏试剂盒则为0.5-10pg/ml，不同试剂盒线性范围不同。
多指标检测技术
液相悬浮芯片技术Luminex
与ELISA类似，Luminex技术也使用双抗体夹心法，其关键创新在于将抗体固定在微球表面。由于微球表面可包被大量抗体，因此大大增加了反应的表面积，提高了检测的灵敏度。
图：Luminex检测原理4
通过使用两种或三种不同的染料，并以不同比例对微球进行染色，可产生多达100种或500种不同颜色的微球。每种颜色的微球都具有独特的编码，并且只固定包被一种抗体，从而实现了编码与靶标的一一对应。由于微球是液态的，可将多种不同编码的微球混合在一起，放入同一个孔中。加入样本和检测抗体后，即可在一个样本中同时检测多种蛋白质。
图：Luminex多色微球
图：Luminex如何实现多指标检测
以同样检测20个指标为例比较Elisa和Luminex的不同，可见当样本量有限但需要检测的靶标众多时，Luminex技术更高效、更节省样本，且性价比更高，是目前应用最为广泛的多指标检测技术之一。
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比较项目 |
Luminex |
Elisa |
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检测靶标数量 |
20 |
20 |
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样品数量 |
80 |
80 |
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检测靶标组合 |
自由组合 |
单项检测 |
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需96孔板数量 |
1块 |
20块 |
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耗时 |
4-6个小时 |
＞4天 |
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所需样品体积 |
25-50ul |
≥20*50μL |
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重复性 |
同板操作影响少 |
多板检测人为因素多 |
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单指标费用 |
低 |
高 |
❖检测平台：Luminex200
❖反应容器：96孔板
❖单孔可检测指标数：1~115
❖样本种属：人、小鼠、大鼠、非人灵长类、犬、猫、牛、马、猪、鸡、羊
❖可检测样本类型：血清、血浆、细胞上清、尿液、组织裂解液、乳汁、唾液、房水、脑脊液、支气管肺泡灌洗液等多种样本类型
❖所需样本体积：25-50μL
❖灵敏度：pg/ml
❖线性范围：3.5- 5.5 logs
电化学发光检测技术Meso-scale Discovery (MSD)
MSD超敏电化学发光技术由美国Meso Scale Discovery公司研发。 与传统的ELISA相似，MSD也是通过双抗体夹心法来定量目标蛋白。但其独特之处在于其采用了石墨烯材质的电极板作为反应容器，这种材质能显著增加捕获抗体的固载量。同时利用SULFO-TAG（三联吡啶钌）替代传统的酶或荧光染料标记在检测抗体上，当电极板通电时，SULFO-TAG发生一系列氧化还原反应，产生光信号，随后被仪器内的CCD相机捕获。MSD是电化学和化学发光两个过程的完美结合，可将许多非特异信号予以排除，受样本性质的影响更小，对于各类生物学样本的兼容度高。
图：MSD检测原理
MSD的一大特点是超高的灵敏度及更宽的线性范围，它的灵敏度之所以可达到飞克级别，主要原因有以下几个方面：
1、石墨烯底板：其单位面积的抗体包被量较常规材质孔板提高约10倍
2、电化学发光技术：
MSD 以SULFO-TAG（三联吡啶钌) 作为发光基质，其分子量约为1000Da（约为HRP的1/40），空间位阻小，易于标记抗体，且不易阻碍其与待测物质的结合；当电极板通电时，三联吡啶钌上的钌元素会发生一系列氧化还原反应，循环反应持续进行并释放出光子，该光信号在620nm处发射，较荧光更稳定，不易淬灭；
3、包被方式：S-PLEX试剂盒孔板包被的是链霉亲和素，将其与生物素抗体结合。由于链霉亲和素与生物素有极高的亲和性，一个链霉亲和素可同时结合四个生物素分子，使得抗体包被量被大大提高。
目前，MSD技术在免疫学、疾病研究和药物开发等多个领域均得到了广泛应用。特别是在神经退行性疾病的研究中，MSD已成为aβ 38、40、42等蛋白检测的金标准，仅需10微升的样本量即可定量检测这些分析物。此外，MSD还提供了包括α-Synuclein、APP、NFL、NFH、Tau（total）、VEGF-A、GFAP以及不同磷酸化位点的Tau（如pT181、pT231、pT217）等在内的多种神经相关指标的检测产品，为科研人员提供了有力的研究工具。
❖检测仪器平台：MSD S120/MSD S600
❖反应容器：石墨烯材质的96或384孔电极板
❖单孔可检测指标数：1-10
❖检测种属：人、小鼠、大鼠、非人灵长类、犬
❖可检测样本类型：血清、血浆、脑脊液、尿液、细胞上清、组织裂解液、乳汁、唾液、房水、支气管肺泡灌洗液等多种样本
❖所需样本体积：10-25μL
❖灵敏度：可达fg/ml
❖线性范围：3–6 logs，线性范围更宽
Cytometric Bead Array（CBA）
与前述Luminex技术类似，CBA也是基于微球的检测方法。不同的是CBA实现多个因子同时检测是利用了流式细胞仪可以识别同一种荧光素不同强度的特点。
将每种微球表面包被特定细胞因子的捕获抗体，通过流式细胞仪对微球和检测抗体上PE的荧光的强度进行分析，从而可以同时定量检测30种分析物。
❖仪器平台：流式细胞仪
❖反应容器：流式管
❖单管检测指标数：1~30
❖样本种属：人、小鼠、大鼠、狒狒、猕猴、恒河猴、牛、猪
❖可检测样本类型：血浆、血清、培养上清、泪液、体液、鼻腔冲洗液、细胞裂解液等液态样本
样本体积：25-50μL
❖灵敏度：常规10 pg/mL，高敏系列0.274pg/mL
❖线性范围：3-4 logs
❖实验步骤：
图：CBA的检测原理与实验流程
❖实验指南
❖相关讲座
抗体芯片
抗体芯片是检测蛋白的一种技术，包括双抗体夹心检测和直接检测两种形式。膜芯片通常是半定量的，采用化学发光或荧光检测，实验操作类似Western Blot，但不需电泳和转膜步骤。玻璃芯片通常是定量的，使用荧光检测。抗体芯片可同时检测多达1,200 种人类蛋白、640 种小鼠蛋白或 67 种大鼠蛋白，主要用于信号转导、蛋白质组学、肿瘤及其他疾病的相关研究。抗体芯片单次实验检测的样本数量较少，以R&D公司的Proteome Profiler系列产品为例，一个试剂盒检测4个样品，更适合做样品数量较少的多指标筛选。
❖仪器平台：膜芯片用化学发光仪，玻璃芯片需用玻璃芯片扫描仪
❖反应容器：膜或玻璃芯片
❖单张芯片可定量检测指标数：人类蛋白≤1200，小鼠蛋白≤640，大鼠蛋白≤67
❖检测种属：人、小鼠、大鼠、猪、牛、马、犬、兔、绵羊、猫、恒河猴、鸡、海豚
❖可检测样本：细胞培养上清、细胞组织裂解液、血清、血浆等
❖样本体积：定量芯片50-100ul
❖灵敏度：~pg/ml
❖实验指南：
❖相关讲座：
单细胞水平的细胞因子检测
酶联免疫斑点实验( ELISpot)
常见的免疫检测方法通常仅可检测由大量细胞产生、释放到组织或各类体液中的细胞因子，或是体外培养细胞释放的细胞因子，测得的是细胞的平均反应，无法检测某类细胞亚群（如抗原特异性 T 细胞或 B 细胞）的细胞因子分泌情况。ELISpot则可以在单细胞水平对抗体分泌细胞(ASC)及细胞因子分泌细胞进行检测。首先，将细胞孵育在包被有捕获抗体的多孔板上，该抗体可捕获分泌的细胞因子。去除细胞后，加入检测抗体，通过显色反应或荧光观察细胞因子的产生。每个产生细胞因子的细胞位置都显示为一个斑点。通过 ELISpot读板仪对斑点进行计数和分析。统计膜上的斑点数目，再除以当初加入孔内的细胞总数，即可以计算出阳性细胞的百分比。
目前，ELISpot的主要应用在以下领域：
1. 免疫学基础研究（T 细胞和 B 细胞，Th0/Th1/Th2 细胞分析）：ELISpot可用来区分被激活的不同T细胞亚群。例如Th1细胞主要分泌IFN-γ,IL-2 和TNF-α，而Th2细胞分泌IL-4,IL-5和IL-13等。
2. 疫苗研究：ELISpot是检测和评价疫苗的细胞免疫水平的国际公认的标准工具，已广泛用于疫苗的研制和评估。
3. 肿瘤免疫研究和免疫治疗/细胞治疗：用于检测肿瘤抗原特异性的细胞免疫反应。
4. 感染性疾病研究与诊断：第一个被SFDA 批准的基于ELISpot法的诊断平台（T-SPOT.TB）已上市，此外，ELISpot还可用于其他感染性疾病如HBV,HCV等的抗感染免疫研究与诊断。
5. 自身免疫疾病研究：如I型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮等疾病病因分析、预测、早期诊断、指导治疗以及预后分析等。
6. 其他：药物筛选、移植免疫研究等，适用于任何想要在单细胞水平研究蛋白分泌的实验。
❖检测平台：ELISpot Reader
❖反应容器：ELISpot 多孔板（通常是96孔板）
❖单次实验检测指标：ELISpot检测单个指标，FluoroSpot最高可测7种
❖可检测样本：人或动物的PBMC、脾细胞、其他类型的免疫细胞，如T细胞、B细胞等
❖灵敏度：1 in 100,000 cells
❖相关讲座：
流式细胞术
（Flow Cytometry,FCM）
流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种在生物医学研究中广泛应用的技术，它通过测量细胞的物理和化学特性来对细胞进行快速、高通量的分析和分选。基于单细胞分析，可检测表达细胞因子的细胞的频率，并通过对细胞内细胞因子和细胞标记物进行染色来表征特定细胞群。流式细胞术能进行多参数分析，分析参数的数量与细胞群、目标细胞因子和流式细胞仪相关。但并非所有细胞因子都能通过单一方案检测到，检测低表达或新鉴定的细胞因子可能需要对染色进行严格优化。此外，细胞内存在细胞因子并不一定意味着它会从细胞中释放出来或在体内表现出生物学效应3。
❖检查平台：BD FACS Celesta等流式检测平台
❖样本类型：心脏、肝、肺、脾、肿瘤、肠、皮肤、血液等样本
常用细胞因子检测方法比较
乐备实公司介绍
乐备实（LabEx），作为多组学和多因子检测分析领域专家，服务范围已扩展至包括单细胞测序、空间多组学、流式检测、电化学发光、液相微阵列、蛋白芯片、抗体芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、多色免疫组化等20多种技术平台。公司已经成功为超过2500个客户提供了服务，年检测样本量超过30万，赢得了广泛的客户赞誉。乐备实一站式多因子平台覆盖了从样本采集、制备、储存、管理到运输，再到检测和数据分析的整个流程，极大地简化了实验操作，同时确保了数据的准确性和可靠性。我们诚邀广大客户前来咨询，体验乐备实一站式多因子平台带来的便捷和高效。让我们一起探索生物医学的奥秘，推动科研和医疗领域的发展。
乐备实是国内专注于提供高质量蛋白检测以及组学分析服务的实验服务专家，自2018年成立以来，乐备实不断寻求突破，公司的服务技术平台已扩展到单细胞测序、空间多组学、流式检测、超敏电化学发光、Luminex多因子检测、蛋白芯片、抗体芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、多色免疫组化等30多个，建立起了一套涵盖基因、蛋白、细胞以及组织水平实验的完整检测体系。
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