ELISA（酶联免疫吸附实验）基于抗原 / 抗体特异性结合与酶催化放大原理，因高灵敏度、特异性及试剂稳定性，广泛用于体外诊断免疫学检验中的抗原 / 抗体定量检测。以下为核心检测方法及实验关键要点：

一、主流检测方法

1. 双抗体夹心法（三明治法）

• • 适用：大分子抗原（如激素、细胞因子）。
  • 原理：
    • 固相载体包被特异性抗体（捕获抗体）→ 加入待测样品，抗原与抗体结合 → 加酶标抗体（检测抗体）→ 底物显色，吸光度值对应抗原浓度。
  • 特点：需两种抗体识别抗原不同表位，灵敏度高。

图1. ELISA夹心法实验流程

• • 适用：小分子抗原或单一表位抗原。
  • 原理：
    • 包被抗体后分两组：
      • A 组：酶标抗原 + 待测抗原 → 竞争结合包被抗体；
      • B 组：仅酶标抗原 → 作为对照。
    • 两组显色差值反映待测抗原浓度（颜色越深，待测抗原含量越低）。

图2. ELISA竞争法实验流程

• • 适用：检测抗体含量。
  • 原理：
    • 固相载体包被抗原 → 加入待测抗体与参考抗体混合液 → 洗涤后加酶标参考抗体 → 显色强度与待测抗体浓度呈负相关（颜色越浅，待测抗体含量越高）。

图3. ELISA免疫抑制法实验流程

• • 直接法：抗原固定于载体 → 加酶标抗体直接显色。
  • 间接法：抗原固定于载体 → 加待测抗体 → 加酶标二抗（抗抗体）显色，放大信号。

图4. ELISA直接法实验流程

二、实验关键步骤与优化

• • 包被：优化抗原 / 抗体浓度与固相载体结合条件，确保有效蛋白充分固定。
  • 封闭：
    • 目的：用封闭剂（如 BSA）覆盖载体未结合位点，防止非特异性吸附。
    • 理想封闭剂要求：阻断非特异性结合、不影响包被物活性、稳定蛋白结构、无酶活性及交叉反应。

• • 酶标抗体需兼具免疫学活性与酶活性，常用酶为 HRP（辣根过氧化物酶）或 AP（碱性磷酸酶）。
  • 底物显色后，通过吸光度值（OD 值）定量分析，颜色深浅与待测物含量正相关（竞争法除外）。

图5. 未封闭与使用封闭剂的抗原抗体结合情况比较

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