一步法 RT-PCR 是指在同一反应体系中完成第一链 cDNA 合成与后续 PCR 扩增的技术模式。
- 流程简化与污染控制：单管反应设计省去了样本转移操作，从根源上降低了交叉污染风险，尤其适合大规模样本的高通量检测场景。在时间敏感性实验（如 RNA 病毒的快速筛查）中，一步法因操作便捷、耗时更短而成为优先选择。
- 靶向扩增效率优化：通过基因特异性引物（GSP）启动逆转录与扩增过程，可显著提升目标 cDNA 的合成效率，同时有效抑制非特异性扩增背景。这一特性使其在低表达基因的检测、基因表达量细微差异的定量分析（如转录组差异研究）中表现突出，检测结果具有较高的准确性。
- 引物与反应条件的双重制约：基因特异性引物的使用限定了单一样本仅能分析少数基因，无法实现多基因的同步检测；此外，逆转录与 PCR 扩增需在同一反应体系中平衡酶活条件，可能导致部分场景下的灵敏度与扩增效率下降。
- 酶促反应的兼容性瓶颈：逆转录酶（Reverse Transcriptase）与 DNA 聚合酶的最佳反应条件存在天然冲突，同一体系下二者的酶活性会相互影响，难以同时达到最优状态。
（1）对逆转录反应的影响
① 模板 RNA 质量要求严苛：一步法 RT-PCR 依赖基因特异性引物启动逆转录，对 RNA 模板的完整性与纯度要求较高。若 RNA 存在降解或杂质污染，会显著降低逆转录效率，直接影响后续扩增结果。
② 反转录效率的天然劣势：两步法 RT-PCR 在逆转录阶段采用 Oligo dT 与 Random Primer 的优化混合引物，其 cDNA 合成产量与效率显著优于一步法中单一的基因特异性引物，尤其适用于低丰度 RNA 或复杂样本的逆转录。
③ 温度依赖性引物二聚体风险：逆转录酶的最适活性温度（37-50℃）与 PCR 引物退火温度重叠，在此区间内上下游引物 3´ 末端易发生非特异性退火，大幅增加引物二聚体形成的概率，干扰目标序列的有效扩增。
引物二聚体的形成，以及逆转录体系中残留抑制剂（如胍盐、酚类物质），均会显著抑制 PCR 扩增效率，影响最终检测结果的准确性。
两步法 RT-PCR 分为两个独立的反应阶段：首先通过逆转录合成第一链 cDNA，再以该产物为模板进行 PCR 扩增。
- RT 过程的灵活性与高效性：
① 宽适模板要求：采用 Oligo dT 与 Random Primer 的优化混合引物，可兼容 1 ng-1 μg 总 RNA 起始量，对 RNA 模板质量要求较低，适配多种样本类型；
② 产物复用性强：逆转录生成的 cDNA 可长期储存，并广泛应用于多场景实验，如高通量基因检测、文库构建及基因克隆等，提升实验资源利用率。
- PCR 过程的优化空间与通量优势：
① 高效扩增保障：通过对 cDNA 进行 5-20 倍稀释，可有效降低 RNA 提取与逆转录过程中残留抑制剂（如乙醇、酚类、胍盐）对 PCR 反应的干扰，显著提升扩增效率；
② 多基因同步分析：同一 cDNA 样本可实现多个靶基因的平行检测，适用于基因表达谱的高通量研究；
③ 条件精细调控：逆转录与 PCR 反应独立进行，便于研究者灵活优化引物设计（如选择 oligo dT、随机引物或基因特异性引物）、酶体系（DNA 聚合酶类型）及反应参数，提升实验结果稳定性。
相较于一步法，两步法 RT-PCR 存在操作流程繁琐、实验周期延长等问题。多次样本处理与反应体系转换，不仅增加了操作误差风险，还可能引入交叉污染，导致实验结果的重复性与一致性下降。
以第一链 cDNA 为模板合成互补链，从而获得双链 cDNA 的过程称为第二链 cDNA 合成。在第一链合成时，建议选用 RNase H 活性极低的逆转录酶，以最大化 cDNA 合成长度与产量，为后续第二链合成提供优质模板。
在 dNTP 存在条件下，利用 RNase H 在 DNA/RNA 杂交链的 RNA 链上产生切口与缺口，进而生成 RNA 引物，再通过大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 催化第二链合成。
① RNA 链切割：E. coli RNase H 对 cDNA/RNA 复合物中的 RNA 链进行切割，为 DNA 合成提供 3'-OH 引物结合位点。
② 切口平移反应：E. coli DNA 聚合酶 I 借助 5´→3´ 聚合酶活性延伸切口处的 RNA 链，同时利用 5´→3´ 外切核酸酶活性沿合成方向逐步替换 RNA 链，完成切口平移过程。
③ 缺口修复：E. coli DNA 连接酶缝合新合成 cDNA 片段间的缺口（不推荐使用 T4 DNA 连接酶，因其会连接双链 cDNA 平末端并形成嵌合结构）。
④ 末端处理：大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 5´→3' 核酸外切酶与 RNase H 共同降解 5'- 末端残留的 mRNA 片段，暴露第一链 cDNA 对应的 3' 端序列；同时，其 3´→5' 核酸外切酶活性消化第一链 cDNA 的 3' 端，最终形成平端或近平端结构。
注：该方法合成的 cDNA 在 5' 端可能存在数个核苷酸缺失，但通常不影响编码区完整性。
T4 DNA 聚合酶具备依赖 DNA 模板的 5´→3´ 聚合酶活性，同时具有针对单链 / 双链 DNA 的 3´→5´ 外切酶活性，但缺乏 5´→3´ 外切酶活性。具体表现为：
- 无 dNTP 时，3´→5´ 外切酶活性可从 3´ 末端降解双链 DNA；
- 补加 4 种 dNTP 后，激活聚合酶活性以延伸 3´ 末端；
- 高浓度 dNTP 条件下，酶促降解反应终止于双链区，此特性可用于双链 DNA 分子的 3´ 末端标记。
通过 NaOH 消化 DNA/RNA 杂合链中的 mRNA 链后，解离的第一链 cDNA 的 3´ 末端会自发形成发夹环（其产生机制尚不明确，推测可能与 mRNA 帽子结构相关），该发夹环可作为现成引物，在 E. coli DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段或反转录酶（DNA 指导的 DNA 聚合酶活性）作用下延伸形成第二链，最后利用单链特异性的 S1 核酸酶消化发夹环结构。
局限性：该方法反应条件难以控制，且 S1 核酸酶切割发夹结构时必然导致 mRNA 5´ 端序列缺失与重排，目前已较少使用。
利用 MMLV 逆转录酶的末端转移酶（TdT）活性（如 SuperScript IV、Maxima H Minus 具备该活性，而 SuperScript III 无此活性），经突变改造后丧失 RNase H 活性的酶会在第一链 cDNA 末端添加 CCC 碱基。因此，可在反应体系中直接加入含 GGG 序列的 TSO（Template Switching Oligo），以第一链 cDNA 为模板合成第二链。该特性广泛应用于单细胞 SMART-seq 中的模板转换反应或 5´RACE 等实验。
① M-MLV 逆转录酶：具备优异的热稳定性，37℃时酶活达到峰值，可高效合成长度达 7 kb 的第一链 cDNA，适用于中等长度转录本的逆转录。
② SuperScript III 逆转录酶（37℃-55℃）：突破传统温度限制，可在 55℃高温下合成第一链 cDNA，产物长度覆盖 100 bp 至 12 kb 以上。该酶通过提升反应特异性，实现 cDNA 及全长产物的高产量合成，尤其适合复杂模板或长片段转录本的逆转录需求。
③ SuperScript IV 逆转录酶（42℃-55℃）：显著增强了对抑制剂的耐受能力，可在血清、组织裂解液等复杂样品中稳定进行特异性 cDNA 合成。反应时间从传统的 50 分钟以上大幅缩短至 10 分钟，且相比 SuperScript III 具有更强的持续合成能力，能有效应对高 GC 含量或二级结构丰富的 RNA 模板。
④ Maxima H Minus 逆转录酶（50℃-55℃）：在 50℃孵育 60 分钟后仍保持 90% 的热稳定性，最高工作温度可达 65℃，为高温逆转录提供可能。其全长 cDNA 合成能力可达 20 kb，支持 1 pg 至 5 μg 总 RNA 的宽范围起始量，15-30 分钟内即可完成高效合成。此外，该酶对常见抑制剂（如胍盐、酚类）耐受性强，还可掺入修饰核苷酸，适用于单细胞测序、修饰 RNA 研究等特殊场景。
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