除了理化特性之外，活性测定是抗体药物质量评价体系中不可或缺的核心环节。生物活性测定旨在量化抗体药物有效成分的含量与药理效价，作为确保抗体类药物临床有效性的关键质量控制指标，需构建完整的表征体系。通常而言，活性测定涵盖生物学活性测定与结合活性测定两大维度。

生物活性测定

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）

 

补体依赖的细胞毒性（Complement-dependent cytotoxicity, CDC）

适用抗体举例：CD20 抗体、CD38 抗体、CD52 抗体等。

细胞增殖抑制实验

• 贝伐珠单抗（VEGF 抗体）：采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖抑制法；
• 曲妥珠单抗（HER2 单抗）：使用表达 HER2 的乳腺癌细胞系（如 BT474）进行增殖抑制实验；
• 西妥昔单抗（EGFR 抗体）：选用表达 EGFR 的肿瘤细胞系（如 A431）开展实验。

细胞因子测定

• ELISA 法：简单高效，用于检测细胞分泌上清中的单一细胞因子；
• ELIspot 与流式细胞术：用于检测分泌细胞因子的细胞；
• 流式 CBA 法或 Luminex 液相芯片技术：适用于多细胞因子 panel 的同步检测；
• 电化学发光法MSD：适用于高灵敏度检测需求场景。

结合活性测定

抗体药物的生物学活性基础在于 Fab 段 CDR 区与抗原的特异性结合，以及 Fc 段与 FcR、C1q、FcRn 等分子的相互作用。因此，测定抗体的结合活性可直接反映其功能特性，常用技术包括表面等离子共振（SPR）、生物膜层干涉（BLI）、时间分辨荧光（HTRF）及 Alpha 技术等。

 

表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）测定法

1902 年 Wood 等人首次观察到由表面等离子体波激发引起的异常衍射现象。SPR 的核心原理是：当入射光从高折射率介质射向低折射率介质界面且入射角超过临界角时，会发生全内反射；若界面存在金属膜，入射光能量将激发金属膜中的等离子体共振，以电磁场形式弥散至低折射率介质，导致反射光能量在特定角度（SPRdip 角）显著降低。
作为一种生物传感器技术，SPR 广泛应用于分子互作分析。当药物与靶点发生结合或解离时，会改变金属膜表面分子浓度，进而引起折射率变化和 SPRdip 角偏移。通过实时监测角度动态，可定量分析分子结合和解离的全过程。

 

 

生物膜层干涉（Bio-Layer Interferometry, BLI）测定法

BLI 技术通过生物传感器实时监测分子互作：生物分子 A 固定于光纤传感器末端形成生物膜，当分子 A 与待测分子 B 结合时，传感器末端分子量增加导致生物膜厚度改变。光通过生物膜层时发生透射与反射，反射光频率受膜厚度影响，不同频率的反射光与入射光产生相长或相消干涉，形成干涉光谱。光谱仪检测光谱相对位移（nm），该位移直接反映生物膜厚度变化，从而实现分子互作的动态监测。

 

 

均相时间分辨荧光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, HTRF）

HTRF 融合了荧光共振能量转移（FRET）与时间分辨荧光（TRF）技术，具有背景低、灵敏度高、高通量等优势。当供体与受体分子（如抗体与抗原 / 受体）距离小于 10nm 时，发生 FRET 并产生信号。双波长检测模式可有效排除缓冲液、培养液等背景干扰，适用于均相体系中的分子互作分析。

 

总 结

抗体药物在完成理化属性分析后，需对活性进行全面表征：结合活性测定直接反映抗体与抗原、效应分子 / 受体（如 FcγRIII、C1q）的结合能力；辅以细胞水平的生物学活性测定（如 ADCC、CDC、细胞增殖抑制、细胞因子分泌、内化作用等），共同构成体外活性表征体系。该体系不仅是抗体药物进入体内实验的基础，更是临床研究成功的重要保障。

  

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