01. 技术简介
邻位连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）是一种用于检测蛋白质相互作用的高灵敏度方法 。其核心是利用特异性抗体靶向结合目标蛋白，这些抗体各自偶联独特的 DNA 探针。当目标蛋白在空间上相互靠近时，与之相连的 DNA 探针也会随之接近。此时，DNA 连接酶可将邻近的探针连接，形成完整的 DNA 模板。经滚环扩增（RCA）技术对该模板进行扩增，会产生大量单链 DNA 。再通过荧光标记探针对这些扩增产物进行检测与定量，能显著放大信号，使原本难以捕捉的微弱蛋白相互作用得以被精准检测。目前，该技术广泛应用于生物医学研究的多个领域，包括蛋白质相互作用机制探究、蛋白质修饰分析以及药物研发过程中靶点验证等工作。
02. 技术原理
PLA 技术的作用流程以特异性抗体结合目标蛋白为起始环节 。抗体提前连接不同的 DNA 探针，当目标蛋白因相互作用而靠近时，关联的 DNA 探针也会在空间上邻近。加入 DNA 连接酶后，邻近的探针可被连接，进而形成完整的 DNA 模板 。随后，滚环扩增（RCA）技术启动，对该模板进行高效扩增，生成大量单链 DNA 产物。荧光标记的寡核苷酸探针可与这些产物特异性结合，实现对产物的检测与定量。RCA 的信号放大特性，让原本微弱的分子相互作用能够被检测系统识别。并且，每个蛋白相互作用事件会对应生成多个荧光信号点，极大地提升了检测的灵敏度 。借助荧光显微镜观察，这些信号点的位置可对应目标蛋白发生相互作用的具体位点。
03. 实验流程
PLA 技术作为高灵敏度检测蛋白质相互作用的手段，借助 DNA 连接与扩增技术，把蛋白质相互作用转化为可检测的 DNA 信号（图 2 ），具体精简步骤如下：
（1）样品制备
对细胞或组织开展固定与透化处理，一方面让抗体能够穿透进入并结合目标蛋白，另一方面封闭非特异性结合位点，减少背景信号干扰 。
（2）抗体孵育
采用偶联 DNA 探针的特异性抗体，对目标蛋白进行标记，为后续反应锚定基础 。
（3）邻位连接反应
加入 DNA 连接酶，促使相互邻近的 DNA 探针发生连接，进而形成环状或线性的反应模板 。
（4）滚环扩增（RCA）
依靠聚合酶对上述模板进行扩增，生成大量 DNA 序列，实现信号的放大增益 。
（5）信号检测
利用荧光标记探针与扩增后的 DNA 结合，产生可在荧光显微镜下识别的信号，以此标示蛋白相互作用的具体位置 。
（6）数据分析
通过剖析荧光信号的数量、分布位置以及强度等参数，对蛋白质间的相互作用情况进行评估 。
04. 应用领域
PLA 技术凭借高灵敏度与特异性，在生物医学研究中开拓出多元应用场景（图 3），以下聚焦关键应用方向展开介绍：
（1）蛋白质相互作用研究
突破亚细胞结构限制，针对细胞膜蛋白、核蛋白、细胞质蛋白等不同定位的蛋白质，精准捕捉其相互作用动态。无论是静态复合物形成，还是瞬时、微弱的蛋白结合事件，均可通过 DNA 信号放大实现可视化与定量分析，助力解析复杂蛋白互作网络 。
（2）蛋白质修饰分析
依托特异性抗体识别体系，PLA 可靶向检测蛋白质磷酸化、泛素化、乙酰化等修饰状态。不仅能鉴定单一修饰位点，还可追踪修饰的时空动态变化，为探究翻译后修饰调控蛋白功能、参与生理病理过程提供直接证据 。
（3）药物研发辅助
在药物作用机制研究与靶点验证中，PLA 可定量评估药物干预对蛋白质相互作用的影响。无论是小分子药物阻断蛋白结合，还是生物药调控蛋白复合物形成，均能通过荧光信号变化，直观反映药物效应，加速药物研发进程中靶点筛选与药效评价环节 。
05. 技术优势
（1）高灵敏度检测能力
可精准识别低丰度蛋白质及其相互作用事件，相较 Western blot、免疫沉淀等传统方法，对微弱信号的捕捉能力显著提升，尤其适用于微量样本或瞬时互作场景的研究。
（2）高特异性识别机制
通过双重特异性抗体匹配与 DNA 连接反应的严格筛选，有效降低非特异性结合导致的假阳性信号。仅当目标蛋白空间距离足够近时，偶联的 DNA 探针才能被连接并启动后续扩增，确保检测结果的可靠性。
（3）原位动态检测特性
支持在细胞或组织样本中进行原位检测，完整保留蛋白质的亚细胞定位与空间分布信息，能真实反映其在生理微环境中的互作状态，避免体外实验导致的人为干扰。
（4）定量分析技术优势
荧光信号的强度与数量和目标蛋白水平呈线性相关，通过标准化数据分析流程，可实现蛋白质相互作用效率与表达量的双重定量，为机制研究提供精准数据支撑。
06. 经典研究案例
案例一：卵巢癌化疗耐药中的信号通路调控研究
2025 年 4 月，天津医科大学肿瘤医院等机构在相关研究中，运用邻位连接技术（PLA）探索 USP9X 与 HIF-2α、SOX2 蛋白的相互作用机制。研究团队选取 HIF-2α 过表达的 OVCA8 细胞，采用抗 USP9X 与抗 HIF-2α/GAPDH 抗体开展 PLA 实验，在细胞核内观察到显著的 PLA 荧光信号，证实 USP9X 与 HIF-2α 存在直接相互作用，且 TGF-β 刺激与低氧环境可显著增强该互作强度。
此外，通过抗 USP9X 与抗 SOX2 抗体的 PLA 检测发现，USP9X 与 SOX2 在细胞核内呈现共定位特征，尤其在 TGF-β 和低氧处理后，两者的空间邻近信号明显增强。该研究揭示了 USP9X 通过整合 TGF-β 与低氧信号，依赖 HIF-2α 维持肿瘤干细胞特性，进而促进卵巢癌化疗耐药的新机制（Zhang et al., 2025）。
案例二：非小细胞肺癌中的蛋白互作机制研究
2025 年 4 月，四川大学华西医院刘伦旭团队在相关研究中，借助邻位连接技术（PLA）探究 RNase1、RAGE 与 ALK 蛋白的空间近邻关系。实验通过特异性抗体标记，在细胞水平检测到 RNase1 与 RAGE、RAGE 与 ALK 之间均产生显著 PLA 荧光信号点，证实三种蛋白在细胞内可形成空间邻近的复合体。该发现揭示了 RNase1 驱动 ALK 激活的致癌机制，为非小细胞肺癌的治疗靶点开发提供了新方向（Zha et al., 2025）。
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