CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）-Cas 系统作为原核生物的适应性免疫系统，通过 RNA 引导的核酸酶实现对外源遗传物质的识别与切割。目前已鉴定的 Cas 蛋白家族包含 6 种主要类型及 22 种以上亚型，其中 Cas9 与 Cas12 因兼具编辑效率与多功能性成为研究焦点。2012 年，Charpentier 和 Doudna 团队首次阐明 Cas9 的可编程切割机制，该发现因其在基因编辑领域的革命性突破获 2020 年诺贝尔化学奖。
分子机制与自然进化
Cas9 蛋白（如化脓性链球菌来源的 SpCas9）为双 RNA 引导的 DNA 内切酶，其天然功能依赖 CRISPR RNA（crRNA）与反式激活 crRNA（tracrRNA）形成复合物，通过碱基互补配对识别目标 DNA 序列。在人工编辑系统中，这两种 RNA 被融合为单链引导 RNA（sgRNA），通过 sgRNA 的序列编程实现靶向切割。
技术优化与应用拓展
保真度提升：Cas9-HF1 等突变体通过减少非特异性 DNA 接触，将靶向切割准确率提升至 99.9% 以上（Smith et al., 2018）。载体小型化：金黄色葡萄球菌来源的 SaCas9（约 3.2 kb）较 SpCas9（约 4.1 kb）更适合腺相关病毒（AAV）载体递送，在体内基因治疗中具有显著优势。
应用场景
Cas9 系统已在哺乳动物细胞基因编辑、转基因作物培育（如抗虫玉米）及生物医学研究中广泛应用，截至目前相关研究文献超 20,000 篇，推动了从农业生物技术到创新药物的产业转化。
结构与功能差异
Cas12 属于 V 型 CRISPR 系统，为单 RNA 引导的内切酶，仅需 crRNA 即可完成靶向识别，其蛋白体积较 Cas9 更小。与 Cas9 的钝端切割不同，Cas12 产生 5' 悬垂末端，但该差异对基因编辑效率无显著影响。
PAM 序列识别特性
Cas9 依赖 5'-NGG-3' 的 PAM 序列（N 为任意碱基），在富含 GC 的哺乳动物基因组中具有广泛靶向性；
原始 Cas12 识别 5'-TTTV-3'（V=A/C/G），其优化变体可识别 5'-TT-3'，但在高等生物基因组中的靶向灵活性仍低于 Cas9。
诊断领域的突破性应用
Cas12 的非特异性单链 DNA 切割活性被开发为 SHERLOCK（Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing）技术，可检测低至飞摩尔级的病毒核酸（如新冠病毒 RNA 逆转录产物），在感染性疾病即时诊断中展现独特优势。
| 特征 |
Cas9 |
Cas12 |
| 系统类型 |
II 型 CRISPR 系统 |
V 型 CRISPR 系统 |
| 引导 RNA |
双 RNA（crRNA+tracrRNA）或 sgRNA |
单 crRNA |
| PAM 序列 |
5'-NGG-3' |
原始型 5'-TTTV-3'，优化型 5'-TT-3' |
| 切割末端 |
钝端 |
5' 悬垂末端 |
| 编辑效率 |
略高于 Cas12 |
略低于 Cas9 但高于 TALENs / 锌指蛋白 |
| 主要应用 |
基因组编辑、动植物育种 |
基因编辑、核酸诊断（如 SHERLOCK） |
五、结论与展望
Cas9 凭借高编辑效率与成熟的技术体系，在哺乳动物基因治疗与基础研究中保持主导地位；Cas12 则因核酸诊断功能拓展了 CRISPR 技术的应用边界，但其在高等生物中的靶向局限性仍需通过蛋白质工程优化。未来，CRISPR 系统的发展将聚焦于编辑精度提升、递送系统创新及知识产权合规性管理，持续推动生命科学研究与生物技术产业的革新。
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