肿瘤浸润 T 淋巴细胞（TILs）的功能状态与肿瘤进展及免疫治疗响应密切相关。耗竭性 T 细胞的功能障碍会削弱抗肿瘤免疫应答，但其功能调控机制尚未明确。单细胞多组学整合技术为揭示这一过程提供了强大工具，本文介绍其在解析 T 淋巴细胞增强子图谱中的应用价值。
一、研究背景与技术基础
肿瘤微环境中 T 淋巴细胞呈高度异质性，传统 bulk 测序难以捕捉群体内差异。本研究采用优化的单细胞 ATAC-seq 技术结合 RNA-seq 数据，实现染色质可及性与基因表达的同步解析。通过优化实验流程，提高了数据信噪比与质量。样本涵盖头颈鳞状细胞癌（HNSCC）、肝细胞癌（HCC）、肾透明细胞癌（ccRCC）及基底细胞癌（BCC），同时纳入癌旁组织及正常供体 PBMC 的 CD8+T 细胞作为对照，确保结果可靠性。
二、肿瘤浸润 CD8+T 细胞的染色质可及性图谱构建
研究对不同肿瘤样本的 CD8+PD1 + 和 CD8+PD1-TILs 细胞进行测序，经质控后获得高质量数据。通过整合分析和降维聚类，识别出 11 种功能状态的 T 细胞亚群。差异分析得到 8453 个细胞类群特异基因，显示不同状态 T 细胞的染色质可及性特征：MAIT 细胞高表达 ZBTB16，naive CD8+T 细胞 LEF1 活性高，记忆 T 细胞 IL7R 活性强，Tpex 细胞 CXCR5 和 TCF7 活性高，功能障碍性 T 细胞则高表达 HAVCR2、ENTPD1 和 TOX。基因集富集分析验证了细胞注释的可靠性。
三、T 细胞亚群的基因调控元件解析
从 11 个亚群中鉴定出 200015 个染色质可及性峰值，差异分析获得 56894 个类群特异性峰值。转录因子 motif 富集显示：naive T 细胞富集 TCF motif，MAIT 细胞含 RORgt，功能障碍性 T 细胞富集 POU motif。通过 chromVAR 软件鉴定出 AP-1、BATF、NFkB 等关键转录因子。UMAP 可视化显示 RORgt 在 MAIT 细胞活性最强，TCF 在 naive 细胞最高，NFkB 和 Nur77 在 Tex 细胞显著。此外，不同肿瘤的功能障碍性 T 细胞存在组织特异性：BCC 亚群富集 bZIP、ETS 等转录因子，RCC 和 HCC 亚群含 T-box 和 RUNX 家族，ccRCC 亚群富集 NFkB，体现肿瘤微环境的特异性影响。
四、耗竭性 T 细胞分化轨迹与多组学整合
对 CD8+T 细胞重聚类得到 6 个亚群，包括终末耗竭性（Tex term）、增殖性耗竭性（Tex prolif）等。拟时序分析显示从 Tpex 到 Tex term 分化中，HAVCR2 活性增强，TCF7 减弱，染色质可及性与转录活性呈动态变化。整合 ATAC-seq 与 RNA-seq 数据，获得 38356 个 CD8+T 细胞转录组图谱，聚类得到 9 个亚群。分析得到 49902 个 peak-to-gene 互作关系，如 EOMES、GZMB 等基因的启动子与增强子共可及，经 HiC 数据验证了互作准确性。
五、超级增强子验证与研究意义
鉴定出各亚群特异的超级增强子相关基因：终末 Tex 细胞含 TOX、HAVCR2 等，Tpex 细胞有 TCF7 和 CXCR5，细胞毒性 T 细胞含 TBX21 等。通过 CRISPRa 激活 PD1 下游增强子，PD1 阳性 T 细胞增多；CRISPRi 干扰 TCF7 上游增强子，TCF7 阳性细胞显著减少，验证了增强子对靶基因的调控作用。综上，单细胞多组学整合解析了 T 细胞状态特异性增强子图谱，为肿瘤免疫治疗提供了潜在靶点与研究方向。
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