均相时间分辨荧光（Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer，TR-FRET）是融合时间分辨荧光（TRF）与共振能量转移（FRET）原理的均相检测技术，凭借高特异性、高灵敏度及无需分离步骤的特性，成为生命科学与药物研发的重要工具。
“均相” 是其核心特征，反应体系中所有试剂无需洗涤、分离即可完成检测，避免了传统异相检测（如 ELISA）的样品损失与操作误差。“时间分辨荧光” 通过延缓信号采集消除瞬时背景干扰；“共振能量转移” 依赖供体与受体的近距离作用（<10nm），仅当两者通过靶标结合时产生信号，确保分子级特异性。这种技术结合了 TRF 的抗干扰能力与 FRET 的互作检测能力，为复杂样品中分子互作的实时监测提供了理想方案。
TR-FRET 的检测机制基于两个关键过程：
共振能量转移（FRET）：当荧光供体与受体距离足够近（1-10nm）时，供体吸收激发光后将能量非辐射性转移至受体，使受体发出特征荧光。这种转移严格依赖分子间近距离作用，仅当供体和受体通过靶标（如蛋白质 - 配体）结合靠近时发生，保证特异性。
时间分辨荧光（TRF）：生物样品的内源性物质会产生瞬时背景荧光（衰减 < 10ns），而 TR-FRET 采用长寿命标记物（如镧系元素螯合物，衰减达数百微秒），通过延迟检测（50-100μs）排除背景，仅采集特异性长寿命荧光，显著提升信噪比。
酶联免疫吸附分析（ELISA）虽成本低、特异性较高，但操作繁琐（多次洗涤、孵育）、易受洗涤效率影响、通量有限。TR-FRET 的优势显著：TR-FRET技术优势：通过延迟检测消除短寿命背景荧光干扰。
无需洗涤：均相体系省去分离步骤，缩短检测时间（从数小时至 30-60 分钟），减少样品损失和人为误差，更适合自动化操作。
抗干扰能力更强：时间分辨特性彻底消除背景干扰，对复杂基质（血清、细胞裂解液）的耐受性优于 ELISA，灵敏度达 pg 级，甚至优于部分放射性检测。
适合动态监测：无需分离，可实时监测分子互作的动力学过程（如配体 - 受体结合速率与亲和力），而 ELISA 仅能检测终点结果。
ELISA原理示意图
TR-FRET 与荧光偏振、HTRF 等均相技术相比，核心优势在于 “时间分辨” 与 “FRET” 的双重特异性。荧光偏振依赖分子旋转速度，易受样品粘度影响；而 TR-FRET 通过能量转移的距离依赖性和长寿命荧光的时间分辨，从空间和时间维度排除非特异性信号，在低丰度靶标或复杂样品检测中表现更优。
HTRF检测示意图
TR-FRET 因操作简便、通量高（适配 384 孔、1536 孔板），成为新药研发的核心筛选技术。在 G 蛋白偶联受体（GPCR）研究中，可检测配体与受体的结合效率（如 Ca²⁺敏感受体 CaSR 的激活通路），快速筛选潜在活性小分子；在激酶活性检测中，通过磷酸化肽段与特异性抗体的结合，用 TR-FRET 信号定量激酶活性，评估候选药物抑制效果。在免疫检查点研究中，TR-FRET 可检测 PD-1 与 PD-L1 的互作，筛选阻断通路的单克隆抗体，为肿瘤免疫治疗药物研发提供高效手段。
在基础研究中，TR-FRET 可实时监测蛋白质 - 蛋白质、蛋白质 - 核酸、配体 - 受体等互作。例如，在细胞信号通路研究中，标记上下游分子（如 MAPK 通路的 ERK 与 MEK）可直观反映通路激活状态；在病毒 - 宿主互作研究中，检测病毒蛋白与宿主受体的结合强度，助力解析病毒入侵机制。
TR-FRET 的高灵敏度和抗干扰能力适合临床样品中低丰度标志物检测。在肿瘤早期诊断中，可检测血清中微量肿瘤标志物（如 CEA、CA125）；在自身免疫疾病诊断中，检测特异性自身抗体（如抗核抗体）提升准确性。与 ELISA 相比，TR-FRET 所需样品量更少（1-10μL），适合微量样本（脑脊液、羊水）分析。
TR-FRET 存在一定局限：镧系标记物成本较高，对标记效率要求严格；高浓度血红蛋白等样品可能吸收荧光影响检测；对分子互作距离要求严格（<10nm），对大分子量复合物适用性有限。未来发展将聚焦三个方向：开发更稳定、低成本的标记物（如量子点 - 镧系复合物），提升经济性；结合微流控、芯片技术实现单细胞超高通量检测；与质谱、成像技术联用，构建多维度分子互作分析体系。
TR-FRET 作为兼具特异性、灵敏度与高通量的技术，已从基础研究拓展至药物研发、临床诊断领域，其发展将为生命科学提供更精准的工具，推动复杂生物过程的深入解析。
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