1 研究背景

2 实验设计

样本获取与细胞分离：从健康人外周血分离外周血单个核细胞（PBMCs），采用 CD4+T 细胞分离试剂结合流式细胞术纯化目标细胞，确保纯度满足实验需求。

样本分组处理：将纯化的 CD4+T 细胞分为两组 —— 刺激组（加 T-Activator 激活）与未刺激组（无激活，作对照），相同条件孵育，控制无关变量一致。

文库构建与测序：经 10X Genomics 平台完成单细胞分离与文库制备，通过 Illumina HiSeq 4000 测序获取原始数据。

数据子集设计：设计两类子集：一是多梯度测序深度子集（基于原始数据随机抽样，设置不同 reads / 细胞）；二是多梯度细胞数量子集（基于全深度数据，设置不同检测细胞数）。

分群准确性评估：以 “全测序深度 + 全细胞数量” 数据为金标准，用随机森林分类模型计算各子集分群准确率，量化与金标准的一致性。

实验设计流程图

3 细胞分群与统计结果

3.1 基础测序指标分析

 

3.2 细胞聚类特征

4 细胞质量与测序深度无关

测序饱和度变化：随深度提升，饱和度先快速升至 90% 左右，随后趋稳，对应每细胞约 70000-90000 个 reads，此深度可基本覆盖转录本，继续提深增益有限。

基因检测数差异：相同深度下，刺激组基因检测数始终高于未刺激组，进一步印证刺激提升细胞转录活性，激活更多基因。

细胞质量与深度的关联性：QC 过滤前后，两组在不同深度下的检测细胞数均稳定，说明识别低质量细胞仅依赖细胞自身指标（如基因检测数、线粒体基因占比），与测序深度无关，排除 “深度影响质量评估” 的干扰。

5 Unstimulated 细胞分群更易受测序深度影响

分群稳定性：刺激组分群稳定性高，即使每细胞仅 5000 个 reads，结果仍与金标准一致；未刺激组在不同平均 reads / 细胞（MRPC）下稳定性差，低深度时部分细胞群无法区分。

分群准确性：未刺激组准确率始终低于刺激组 —— 深度接近每细胞 65000 个 reads 时，未刺激组准确率 82.6%，刺激组达 91.3%。

细胞类型匹配一致性：图 3（全深度与低 / 高深度子集细胞类型比较统计）热图显示，深度大幅变动时，未刺激组细胞错误分类比例更高，证实其分群对测序深度更敏感。

图2 不同条件下两数据集细胞分类的准确性

 图3 全测序深度和低/高深度子集的细胞类型比较统计

6 细胞数量比测序深度更重要

细胞数量对准确性的影响：两组细胞数量减少均导致准确率显著下降。高深度下，未刺激组 2500 个细胞时准确率降至 80%，500 个细胞时不足 60%；刺激组 3500 个细胞时准确率低于 90%，1000 个细胞时降至 70% 以下，500 个细胞时亦低于 60%。

两者影响权重比较：相同细胞数量下，不同深度的准确率差异小；相同深度下，不同细胞数量的准确率差异显著。这证实细胞数量对 CD4+T 细胞分群准确性影响更深远，且至少需 2500 个检测细胞保证分群精准。

 图4 热图展示测序深度和细胞量对细胞分群精度的影响

7 受刺激细胞的细胞类型更易识别

8 讨论与总结

测序深度优化阈值：未刺激 CD4+T 细胞需每细胞约 6-7 万 reads 实现精准分群；刺激组因转录组特异性强，对深度要求低，低深度即可保证高准确率。

细胞数量临界值：无论刺激状态，CD4+T 细胞分群需至少 2500 个检测细胞，低于该数量将导致准确率大幅下降，无法反映真实异质性。

实验设计指导意义：为 scRNA-seq 实验提供量化参考 —— 静息态细胞（如未刺激 CD4+T 细胞）需优先保证测序深度；活化态细胞可适当降深节约成本，但需确保检测细胞数≥2500 个。研究结论对其他高异质性细胞的实验设计亦有参考价值，助力优化方案、平衡成本与数据质量。

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