一、技术概述与原理

邻位连接技术（Proximity Ligation Assay, PLA）是一种基于抗体识别与核酸扩增的高灵敏度检测方法，专门用于在单细胞水平上可视化并定量分析空间距离小于40纳米的蛋白质相互作用。该技术通过将抗原-抗体反应的特异性与核酸扩增的信号放大能力相结合，实现了对目标蛋白互作的原位、精确定位与定量分析。

其核心技术原理在于：针对目标蛋白的特异性一抗分别与带有互补序列的DNA探针的二抗结合。当两个目标蛋白在细胞内空间距离接近（<40 nm）时，其连接的DNA探针随之靠近，在连接酶作用下环化成完整的环形DNA模板。随后通过滚环扩增（RCA）产生大量单链DNA重复序列，并使用荧光标记的寡核苷酸探针进行检测。最终，荧光显微镜下的每个荧光信号点即代表一处蛋白质相互作用的位点，实现“所见即所得”的直观分析。

二、PLA标准实验流程

以研究细胞内蛋白-蛋白互作为例，PLA的标准操作流程包含以下关键步骤：

   样品制备：采用4%多聚甲醛对细胞进行固定，以保持蛋白的原始空间构象与互作状态，随后使用Triton X-100进行温和透化处理，确保抗体能够有效进入细胞内。

   抗体孵育：依次加入针对两个目标蛋白、来源于不同宿主的一抗，孵育后加入对应物种特异的、偶联有DNA探针的PLA二抗。

   连接反应：在连接酶作用下，当两个DNA探针因蛋白互作而空间邻近时，其末端互补序列被连接形成闭环DNA模板。

   滚环扩增与荧光标记：利用Phi29 DNA聚合酶进行等温滚环扩增，生成包含大量重复序列的DNA产物，随后加入荧光标记的检测探针进行杂交标记。

   信号检测与分析：使用共聚焦显微镜观察样本，每个互作事件显示为一个离散的荧光点。通过统计单个细胞内的荧光点数量，可实现对互作频率的定量比较。

三、PLA在生命科学研究中的前沿应用

PLA技术因其高灵敏度、空间分辨率及原位检测能力，已在多领域前沿研究中成为验证关键蛋白相互作用的核心工具。

1. 细胞黏附与力学传感机制
研究显示，在肝癌细胞中，TNS1与整合素β1（ITGB1）的相互作用受细胞外基质黏弹性调控。高黏弹性环境显著增强PLA检测到的互作信号，提示力学微环境可通过调控黏附复合物的组装动态影响细胞行为。

2. 昼夜节律与缺氧信号整合
在人心肌细胞中，PLA证实了生物钟核心蛋白BMAL1与缺氧诱导因子HIF2A在细胞核内存在特异性相互作用，其结合强度显著高于BMAL1与HIF1A的互作，揭示了昼夜节律与缺氧应答在转录水平上的直接耦合机制。

3. DNA损伤应答与修复
研究利用PLA技术，在DNA损伤诱导的HeLa和U2OS细胞中，揭示了组蛋白H1.4的去酰胺化修饰（N76D/N77D）与DNA损伤标志物γH2AX在损伤染色质区域的高度共定位，为理解染色质重塑在DNA损伤修复中的作用提供了直接证据。同时，PLA也用于验证RAD52与SMARCAL1在DNA复制应激下的核内互作，其信号可被RAD52抑制剂显著抑制。

4. 转录-复制冲突机制
在HeLa细胞中，PCNA与RNA聚合酶II（RNAPII）的核内相互作用被PLA直接捕捉。当TIPIN或TIMELESS等复制相关因子缺失时，PLA信号增强，直观反映了转录-复制冲突（TRCs）的增加；该互作信号可被转录抑制剂DRB显著抑制。

5. 神经与内分泌系统信号传导
在小鼠纹状体的星形胶质细胞中，PLA揭示了µ-crystallin（Crym）与MAP2或USP9X在胞体及突起的特异性相互作用，且该互作在中央纹状体区域显著增强。此外，PLA证实了FGF23与FGFR1c/FGFR3c/FGFR4在HEK293T细胞膜表面的复合物形成。

6. 细胞器膜蛋白互作与质量调控
PLA技术成功定位了内质网膜蛋白ARL6IP1与FAM134B在小鼠胚胎成纤维细胞及HEK293T细胞内质网膜网络区域的相互作用，敲除任一蛋白均导致信号显著减少，验证了其互作特异性。

7. 免疫调控与跨细胞互作
一项创新性研究利用PLA在T细胞与星形胶质细胞共培养体系中，检测到TRAIL与死亡受体DR5在两种细胞接触界面上的特异性“膜-膜”相互作用，为理解免疫细胞与非免疫细胞间的直接通讯提供了可视化证据。

8. 激酶信号与酶复合物形成
在H1299细胞中，PLA验证了ALK与RNase1在胞质及近膜区域的相互作用，提示两者可能形成功能性复合物参与信号传导。

四、技术优势与展望

PLA技术的核心优势在于其将免疫检测的特异性与核酸扩增的敏感性相结合，实现了对低丰度、瞬时性蛋白互作的原位可视化。它不仅能够回答“蛋白是否互作”，更能精确揭示“互作发生在何处”，为理解蛋白功能的细胞空间组织方式提供了强大工具。

未来，随着多色PLA、活细胞PLA成像以及与其他超分辨率成像技术联用方案的发展，该技术将在解析动态、多维的细胞信号网络，以及推动精准医学和药物靶点发现中发挥越来越重要的作用。

五、PLA蛋白互作哪个品牌有？

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货号：LXR-PLA

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