二、摘要解读

三、研究思路与结果解析

（一）AURKB 是胆管癌的特异性依赖靶点且高表达提示不良预后

研究思路

实验结果

1. 对 23 种胆管癌细胞系的 CRISPR 敲除筛选及 CERES 依赖分数分析，筛选出 AURKB、PLK1、CDK1 等 6 个潜在激酶靶点，其中仅 AURKB 高表达与胆管癌患者较差总生存期显著相关（图 1A-C）。
2. 临床样本验证显示，AURKB 在胆管癌组织中高表达，癌旁正常组织中几乎不表达，且其表达水平与患者术后复发风险呈正相关（图 1G-J）；HTVi 诱导的小鼠胆管癌模型（KRASG12D/sgp19、YAPS127A/myr-AKT 等）进一步证实 AURKB 仅在肿瘤组织中特异性表达（图 1K）。
3. 表观遗传机制研究表明，AURKB 启动子区低甲基化是其高表达的关键原因：胆管癌组织中 AURKB 启动子甲基化水平显著低于癌旁组织，且与 AURKB 蛋白表达呈负相关；DNA 甲基转移酶抑制剂（地西他滨）处理或敲低 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B 可显著上调 AURKB 的 mRNA 及蛋白表达（图 1L-N）。

（二）AURKB 在胆管癌进展中发挥不可或缺的作用

研究思路

实验结果

1. 细胞实验显示，AURKB 敲低或敲除可显著抑制胆管癌细胞增殖（CCK-8 实验，图 2B）、减少集落形成（图 2C）、降低 DNA 复制能力（EdU 实验，图 2D）；而 AURKB 过表达则显著促进细胞生长（图 2G）。
2. 动物实验证实，AURKB 敲低可抑制皮下移植瘤生长（图 2E），敲除则几乎完全阻断 HTVi 诱导的胆管癌形成（图 2J-L）；相反，AURKB 过表达显著加速肿瘤进展，缩短小鼠生存期（图 2M-R）。需注意的是，AURKB 敲低细胞在培养过程中存在表达反弹现象，导致肿瘤部分复长，而 CRISPR/Cas9 介导的敲除可实现更稳定的抑癌效果（图 2F）。
3. 患者来源类器官模型中，AURKB 靶向 sgRNA 病毒可显著抑制 AURKB 阳性类器官的生长及直径增大（图 2H-I），而对 AURKB 阴性类器官无明显影响；激酶活性突变体（AURKBK106R）无法逆转 AURKB 敲除导致的生长抑制，证实 AURKB 的促癌功能依赖其激酶活性。

（三）AURKB 通过增强肿瘤内胆固醇生成促进胆管癌进展

研究思路

实验结果

1. RNA-seq 分析显示，AURKB 敲低后 “胆固醇代谢通路” 在 QBC939、HuCCT1 细胞中均显著富集（图 3A）；靶向脂质组学证实，AURKB 敲除可显著降低细胞内固醇类脂质（尤其是胆固醇）的总量及各亚型含量（图 3B-E）。
2. Filipin III 染色（检测细胞内游离胆固醇）及 Amplex Red 胆固醇定量实验显示，AURKB 敲低或敲除可显著降低胆管癌细胞及类器官中的胆固醇水平（图 3F-G，补充图 S4C）；AURKB 抑制剂 AZD1152 可剂量依赖性降低肿瘤胆固醇（图 3I）；而 AURKB 过表达则显著升高胆固醇水平（图 3H），且该效应依赖其激酶活性。
3. 临床样本及动物模型验证显示，胆管癌组织中胆固醇水平显著高于癌旁组织（图 3K），且与 AURKB 表达呈正相关（图 3L）；胆固醇补充可缓解 AURKB 敲除对类器官生长的抑制作用（图 3M），证实 AURKB 通过促进肿瘤内游离胆固醇生成推动胆管癌进展。

（四）AURKB 通过增加肿瘤内游离胆固醇损伤胆管癌抗肿瘤免疫微环境

研究思路

实验结果

1. scRNA-seq 分析（KRASG12D/sgp19 模型）显示，AURKB 敲低（shAurkb）组肿瘤浸润 CD8+ T 细胞比例显著升高，巨噬细胞及单核细胞比例降低（图 4A-B）；CD8+ T 细胞功能分析显示，shAurkb 组富集 “抗原呈递”“细胞毒性” 等免疫激活通路，而对照组富集 “ATP 合成”“糖代谢” 等代谢通路（图 4C）。
2. CD8+ T 细胞亚型分析及 pseudotime 轨迹显示，AURKB 敲低可促进 naive T 细胞（TN）向效应 T 细胞（TE）分化，减少向耗竭 T 细胞（TEX）转化（图 4D）；效应谱系中 shAurkb 组的细胞毒性评分显著更高，而对照组的耗竭评分更高（图 4E）。
3. 流式细胞术验证显示，shAurkb 组肿瘤中 Granzyme B+CD8+、IFNγ+CD8+ T 细胞比例显著升高，PD-1+CD8+ T 细胞比例降低（图 4F）；效应 T 细胞（CD44+CD62L-CD8+）比例也显著增加；相反，AURKB 过表达则产生完全相反的免疫抑制效应。
4. 机制验证实验显示，胆固醇补充可逆转 AURKB 敲除对 T 细胞功能的增强作用，而胆固醇耗竭剂（M-β-CD）则模拟 AURKB 敲除的免疫调节效果（图 4G）；T 细胞杀伤实验证实，与 AURKB 敲除细胞共培养的 CD8+ T 细胞对野生型胆管癌细胞的杀伤能力显著增强，而胆固醇补充可阻断该效应（图 4H）。高胆固醇饮食（HCD）小鼠模型进一步证实，HCD 可逆转 AURKB 敲低的抑癌效果及对 CD8+ T 细胞功能的改善作用（图 4L-O）。

（五）AURKB 通过 NCEH1 调控肿瘤内胆固醇水平

研究思路

实验结果

1. 联合分析显示，NCEH1（中性胆固醇酯水解酶 1）是 AURKB 调控胆固醇代谢的关键下游靶基因：ATAC-seq 显示 AURKB 敲除可降低 NCEH1 启动子区的染色质可及性（图 5C），RNA-seq 及 qPCR 证实 AURKB 敲低或敲除显著降低 NCEH1 的 mRNA 及蛋白表达（图 5D-E），且该效应依赖 AURKB 激酶活性。
2. 组蛋白修饰机制研究显示，AURKB 可通过催化 H3S10 磷酸化，减少 H3K9me3 在 NCEH1 启动子区的富集（ChIP-qPCR，图 5L）；同时，AURKB 促进 H3K9me3S10ph（H3K9me3 与 H3S10ph 的组合修饰）的形成，该修饰无法与 HP1 复合物结合，从而解除 H3K9me3 对 NCEH1 的转录抑制（图 5N）。
3. 功能验证显示，NCEH1 过表达可挽救 AURKB 敲除导致的胆固醇水平降低（图 5H）及肿瘤生长抑制；而 NCEH1 敲低则显著逆转 AURKB 过表达诱导的胆固醇积累及免疫抑制（补充图 S12E-I）。临床样本中，NCEH1 在胆管癌组织中高表达，且与 AURKB、H3K9me3S10ph 表达呈正相关（图 5I、P）。

（六）靶向 AURKB 或降低肿瘤胆固醇可增强胆管癌化疗免疫治疗敏感性

研究思路

实验结果

1. 体外实验证实，AZD1152 与吉西他滨、顺铂联合使用对胆管癌细胞具有协同细胞毒性，显著降低化疗药物的 IC50 值（图 7A-B）；低剂量组合即可显著诱导细胞凋亡，且 AURKB 敲低可增强胆管癌细胞对吉西他滨的敏感性。
2. 患者来源类器官及 PDX 模型显示，AZD1152 可显著抑制 AURKB 阳性类器官的生长（图 7D），在 PDX 模型中，AZD1152 与吉西他滨联合治疗的抑瘤效果显著优于单药治疗（图 7G-H），且仅 AZD1152 可降低肿瘤内胆固醇水平（图 7I）。
3. 免疫联合治疗实验显示，AZD1152 与抗 PD-1 抗体联合可显著抑制免疫 competent 小鼠的胆管癌进展，增加肿瘤内 CD8+ T 细胞浸润及细胞毒性，减少耗竭表型（图 7Q）；辛伐他汀（胆固醇降低药物）可模拟 AZD1152 的作用，显著抑制肿瘤进展并增强化疗免疫治疗效果（图 8A-F）。
4. 临床样本分析显示，化疗免疫治疗后无复发的胆管癌患者肿瘤内 AURKB、NCEH1、H3K9me3S10ph 表达及胆固醇水平显著更低，CD8+ T 细胞功能更强（图 7J-L），进一步验证了 AURKB - 胆固醇 - 免疫抑制轴的临床意义。

⭐⭐四、LabEx 单细胞测序技术的关联与应用⭐⭐

（一）技术应用场景

（二）关键结果产出

1. 免疫细胞亚型分类与比例变化：通过 scRNA-seq 共鉴定出 12 种免疫细胞亚型（包括 T 细胞、巨噬细胞、单核细胞、粒细胞等），发现 shAurkb 组 CD8+ T 细胞比例显著升高，巨噬细胞及单核细胞比例降低（图 4A，补充图 S5A-B）；对 T 细胞进一步分群，鉴定出 11 个 T 细胞亚型，其中 CD8+ T 细胞为主要群体，且 shAurkb 组效应 CD8+ T 细胞（TE）比例升高，耗竭 CD8+ T 细胞（TEX）比例降低（图 4B，补充图 S5C-D）。
2. CD8+ T 细胞功能与分化轨迹分析：通过基因集富集分析（GSEA）发现，shAurkb 组 CD8+ T 细胞富集 “免疫激活”“细胞毒性” 相关通路（如抗原呈递、IFNγ 信号），而对照组富集 “代谢相关通路”（图 4C，补充图 S5I）；利用 Slingshot 工具进行 pseudotime 轨迹分析，显示 shAurkb 组可促进 naive CD8+ T 细胞向效应谱系（TN-TEM-TE）分化，减少向耗竭谱系（TN-TEM-TEX）转化（图 4D）；通过 AddModuleScore 函数计算细胞毒性评分（Gzmb、Ifng 等基因）及耗竭评分（Pdcd1、Ctla4 等基因），证实 shAurkb 组效应谱系的细胞毒性评分更高，对照组耗竭评分更高（图 4E，补充图 S5K）。

（三）对应实验图

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