一、靶向PGK1抑制糖酵解-激酶双功能调控巨噬细胞炎症因子表达及其在结肠炎治疗中的潜力

糖酵解代谢酶通过感知代谢状态变化，在免疫代谢领域发挥关键调控作用。磷酸甘油酸激酶1（PGK1）作为糖酵解途径中的关键催化酶，其功能调控受到广泛关注。本研究首先构建了高通量筛选平台，成功鉴定出一种新型PGK1抑制剂DC-PGKI。该抑制剂以ATP竞争性方式结合PGK1，解离常数（Kd）为99.08 nmol/L，表现出高亲和力。研究证实，DC-PGKI在体外及体内均能稳定PGK1蛋白水平，并有效抑制其糖酵解活性与激酶功能。进一步研究发现，DC-PGKI可显著影响脂多糖（LPS）刺激下巨噬细胞的炎症应答，具体表现为抑制白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的产生。机制研究表明，抑制PGK1可导致核因子E2相关因子2（NRF2，由NFE2L2基因编码）在细胞内积累，并促进其向细胞核转位。进入细胞核的NRF2能够结合于*Il-1b*与*Il-6*基因的邻近调控区域，从而抑制LPS诱导的上述基因转录表达。在疾病模型中，应用DC-PGKI干预能有效缓解葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎症状。上述结果不仅证实了PGK1在巨噬细胞炎症反应中的关键调节作用，也揭示了靶向PGK1开发抑制剂为炎症性肠病等炎症性疾病提供潜在治疗策略的科学依据。

二、基于反向偶联反应的PGK1高通量筛选平台建立与抑制剂鉴定

为筛选靶向PGK1的小分子抑制剂，本研究建立了一种基于酶偶联反应的高通量检测平台。该平台利用PGK1与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）共同催化的可逆反应特性，通过监测NADH在340 nm处的吸光度变化，间接反映PGK1的催化活性。具体而言，在含有3-磷酸甘油酸（3-PG）、ATP、NADH及过量GAPDH的反应体系中，加入PGK1可启动逆反应生成1,3-二磷酸甘油酸（1,3-BPG），后者立即被GAPDH还原并伴随NADH消耗，从而实现对PGK1酶动力学的实时监测（图1A）。

首先，对从大肠杆菌表达系统纯化的重组PGK1进行酶学表征，其动力学参数（1,3-BPG的Km = 189.4 ± 4.8 μmol/L，ATP的Km = 1.30 ± 0.11 mmol/L，Kcat = 956 ± 41.7 s⁻¹）与已报道的人源PGK1数据一致。经条件优化，最终确定反应体系中PGK1与GAPDH的最佳浓度分别为0.40 nmol/L与0.10 μmol/L，以保证GAPDH始终处于过量状态。该检测体系在验证中显示出良好的稳定性与重现性，其Z因子为0.54，符合高通量筛选要求（图1B）。

利用该平台对内部化合物库进行初步筛选，在单剂量50 μmol/L条件下选取抑制率高于50%的化合物进行剂量-反应分析，并进一步通过GAPDH单独催化实验排除非特异性干扰分子。最终鉴定出包括dorsomorphin、purvalanol A、MK-571及LTP-10在内的多个PGK1抑制剂，其IC50值介于1.96至25.24 μmol/L之间（图1C–D）。其中，purvalanol A的抑制活性（IC50 = 1.96 μmol/L）与文献报道一致，证实了本筛选体系的可靠性。为进一步探究其作用机制，选取具有新颖化学结构的LTP-10进行深入分析。酶动力学研究表明，LTP-10对底物3-PG表现为非竞争性抑制，而对ATP则呈现竞争性抑制模式，其Ki值为2.59 ± 0.01 μmol/L（图1E–F）。此外，热稳定性实验表明，LTP-10可显著提高PGK1的热变性温度，提示其可能通过结合并稳定PGK1蛋白构象发挥抑制作用。以上结果验证了该筛选平台在发现与表征PGK1抑制剂方面的有效性与应用价值。

三、DC-PGKI通过靶向PGK1抑制巨噬细胞炎性因子IL-1β与IL-6的表达

代谢重编程在免疫细胞炎症应答中发挥关键作用，尤其与有氧糖酵解过程密切相关。先前研究表明，糖酵解酶PKM2可通过磷酸化STAT3等信号分子，促进白细胞介素-1β（IL-1β）与白细胞介素-6（IL-6）的表达，其小分子抑制剂在多种炎症模型中显示出治疗潜力。受此启发，本研究探讨了另一关键糖酵解酶PGK1是否在巨噬细胞炎症调控中具有类似功能。

本研究利用PGK1抑制剂DC-PGKI作为化学探针，在脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7细胞及原代骨髓来源巨噬细胞（BMDM）中评估其对炎性因子表达的影响。结果显示，DC-PGKI以浓度依赖性方式显著抑制LPS诱导的*Il-1b*与*Il-6*的mRNA表达（图4A–B），并降低其蛋白水平（图4C），而对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达无显著影响。与已知糖酵解抑制剂2-DG及PKM2特异性抑制剂TEPP-46/DASA-58相比，DC-PGKI对IL-1β与IL-6均具有抑制作用，提示其作用机制可能不仅限于干扰糖酵解代谢途径。为进一步验证DC-PGKI的作用依赖于PGK1，本研究通过RNA干扰技术敲低巨噬细胞中PGK1的表达。结果显示，PGK1敲低可模拟DC-PGKI的效应，显著抑制IL-1β与IL-6的产生（图4E–G），且不影响TNF-α表达。此外，在PGK1敲低细胞中回补表达siRNA抗性的PGK1蛋白，可恢复IL-1β与IL-6的表达水平（图4H），表明DC-PGKI对炎性因子的抑制作用是经由PGK1介导的。综上，本研究证实PGK1在巨噬细胞炎症应答中具有重要调控功能，其抑制剂DC-PGKI可通过靶向PGK1选择性抑制IL-1β与IL-6的表达，为炎症性疾病的靶向治疗提供了新的实验依据。

四、DC-PGKI通过KEAP1-NRF2通路抑制IL-1β与IL-6表达

既往研究提示，抑制PGK1可能影响KEAP1的翻译后修饰，从而促进核因子E2相关因子2（NRF2）的积累及其下游抗氧化基因的转录。类似地，内源性代谢物衣康酸可通过修饰KEAP1激活NRF2并发挥抗炎作用。基于此，本研究进一步探讨DC-PGKI是否通过调控NRF2通路介导其抗炎效应。

结果表明，DC-PGKI处理可呈时间与浓度依赖性地下调KEAP1蛋白水平，并相应增加NRF2蛋白表达及其经典下游靶基因血红素加氧酶1（HMOX1）的mRNA与蛋白水平（图5A–C）。在脂多糖（LPS）刺激与否的条件下，DC-PGKI均能显著上调包括Txnrd1、Prdx1、Gclc、Sod1等在内的多个NRF2调控基因的表达（图5E–H）。此外，在293T细胞中进行的NRF2依赖性荧光素酶报告基因实验进一步证实DC-PGKI可激活NRF2转录活性（图5D）。在KEAP1突变或缺失的细胞系中，DC-PGKI未引起NRF2积累，表明其作用具有KEAP1依赖性。为明确NRF2在DC-PGKI抑制炎性因子表达中的作用机制，本研究通过染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）分析发现，经DC-PGKI处理后，NRF2在Il-1b、Il-6及经典靶基因Nqo1启动子邻近区域的结合显著增强（图6I–K），而对照基因血栓烷合酶（Txs）内含子区未见明显变化。综上所述，DC-PGKI可通过降低KEAP1蛋白稳定性，促进NRF2核转位及其与靶基因启动子的结合，从而抑制IL-1β与IL-6的表达。该结果揭示了PGK1抑制剂调控炎症反应的一条新机制，即通过激活KEAP1-NRF2抗氧化通路实现抗炎作用。

五、总结

本研究围绕糖酵解关键酶PGK1在巨噬细胞炎症反应中的调控作用展开系统性探索。首先，成功构建了基于反向酶偶联反应的高通量筛选平台，并鉴定出新型ATP竞争性抑制剂DC-PGKI。该抑制剂不仅有效抑制PGK1的糖酵解与激酶双功能，更通过靶向PGK1选择性抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症因子IL-1β和IL-6表达，而对TNF-α无显著影响。进一步机制研究表明，DC-PGKI通过促进KEAP1降解，激活NRF2信号通路，增强NRF2核转位及其与*Il-1b*、*Il-6*基因启动子区域的结合，从而在转录水平抑制炎症因子表达。最终，在DSS诱导的结肠炎模型中，DC-PGKI展现出明确的治疗潜力。本研究成果不仅揭示了PGK1在免疫代谢调控中的新功能，也为其作为炎症性疾病（如炎症性肠病）的治疗靶点提供了理论与实验依据。

六、IL-1 β/L-1F2细胞因子检测哪里有？

IL-1β（又名IL-1F2）是固有免疫与炎症反应的核心介质，在感染、损伤及肿瘤微环境中起关键驱动作用。其信号通过调控炎性细胞浸润、免疫细胞分化及细胞因子级联，深度重塑肿瘤免疫应答格局。

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