一、TRIzol法提取总RNA技术概述
（一） 实验原理
TRIzol法是一种基于相分离原理，可从多种生物样本（如动物组织、培养细胞、植物材料及细菌）中快速、有效提取总RNA的常用方法。其核心试剂为含有异硫氰酸胍、苯酚、β-巯基乙醇及8-羟基喹啉等成分的单一组分裂解液。在匀浆或裂解过程中，该试剂能迅速破坏细胞结构，同时强效抑制内源性及外源性核糖核酸酶（RNase）活性，从而保证RNA在提取过程中的完整性。
加入氯仿并离心后，溶液分为三相：上层为含有RNA的水相；中间层主要为变性的DNA及蛋白质；下层为有机相。通过选择性回收水相，并使用异丙醇沉淀其中的RNA，即可实现RNA与大部分DNA及蛋白质的分离。后续采用乙醇洗涤以去除残留杂质，最终将纯净的RNA沉淀溶解于无RNase水中备用。
（二） 关键试剂及其作用机制
👉异硫氰酸胍：一种强效的蛋白质变性剂和离液剂。它能破坏蛋白质的高级结构，导致细胞裂解，并使核蛋白复合体解离，从而高效释放核酸，同时使蛋白质（包括RNase）变性失活。
👉苯酚与8-羟基喹啉：苯酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效促使蛋白质与核酸解离，并进一步使RNase失活。8-羟基喹啉作为抗氧化剂和金属离子螯合剂加入，可与氯仿协同作用，增强对RNase活性的抑制。
👉β-巯基乙醇：作为还原剂，能断裂蛋白质（包括RNase）中的二硫键，辅助破坏其空间构象，增强对RNase活性的抑制效果。
👉氯仿：主要功能是促进相分离，使水相与有机相分层更迅速、界面更清晰。它也有辅助变性蛋白质和去除核酸溶液中微量苯酚的作用。离心后，RNA选择性分配于上层水相。
👉异丙醇：用于沉淀水相中的RNA。其沉淀核酸的选择性与浓度有关，在特定条件下主要沉淀较大分子量的RNA（如rRNA、mRNA），对某些小分子RNA（如5S rRNA、tRNA）沉淀效率可能较低。因此，电泳图谱中5S rRNA条带信号弱，并不一定意味着RNA发生降解。
👉乙醇（75%）：主要用于洗涤RNA沉淀，以去除残留的异丙醇、盐离子及其他可溶性杂质，提高RNA纯度。低浓度的乙醇易于挥发，不会干扰后续实验。
（三） 方法特点
该方法具有操作简便、适用范围广、提取快速等优点。实验前需确保准备好关键试剂（TRIzol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇、无RNase水）及经无RNase处理的耗材（如离心管、枪头等），以避免RNA在操作过程中被降解。
二、实验操作流程与质量评估
（一） RNA提取步骤
1、样本裂解与匀浆
✔️培养细胞：收集处于对数生长期的细胞（通常建议细胞汇合度达80%以上）。去除培养基后，每孔加入适量预冷的TRIzol裂解液，并反复吹打以充分裂解细胞。裂解产物可在室温静置5分钟，以确保核酸与蛋白质复合物充分分离。若后续无法立即处理，裂解液可置于-80℃条件下长期保存。
✔️组织样本：将适量新鲜或冻存组织置于预冷的匀浆管中，并加入适量TRIzol裂解液。使用组织匀浆仪进行充分匀浆，注意组织体积不应超过裂解液体积的10%，以确保有效的裂解效率。
2、相分离
✔️向上述均质化的裂解产物中加入氯仿，其加入体积约为TRIzol原体积的20%。随后温和地颠倒混匀（避免使用涡旋振荡器，以防基因组DNA发生机械剪切），室温静置2-3分钟。
✔️在4℃条件下，以12,000 × g的离心力离心15分钟。离心后溶液将分为三层：上层为含有RNA的无色水相；中间层为蛋白质与DNA构成的白色界面；下层为苯酚-氯仿有机相。
3、RNA沉淀与洗涤
✔️小心地将上层水相转移至一个新的无RNase离心管中，操作时应严格避免触及中间层。若需同时提取DNA或蛋白质，可保留有机相于4℃暂存。
✔️向含有水相的离心管中加入等体积的异丙醇，温和地上下颠倒混匀，室温静置5-10分钟以沉淀RNA。
✔️在4℃条件下，以12,000 × g的离心力离心10分钟，可见RNA沉淀于管底或管壁。
✔️小心弃去上清液，加入适量预冷的75%乙醇（用无RNase水配制），轻柔吹打或涡旋以洗涤RNA沉淀。
✔️在4℃条件下，以12,000 × g的离心力再次离心5分钟，弃去乙醇上清。
4、RNA溶解
✔️短暂离心并吸除残留的乙醇，将离心管盖打开，置于超净工作台中风干片刻（通常3-5分钟）。注意避免RNA沉淀完全干燥，否则将难以重新溶解。
✔️根据预期的RNA产量，加入适量无RNase水溶解沉淀。
（二） RNA浓度与纯度测定
通常使用微量分光光度计或NanoDrop系统进行测定。其原理基于核酸与杂质在特定波长下的吸光度差异：
RNA在260 nm波长处有最大吸收峰，其浓度计算公式为：浓度 (μg/mL) = OD260 × 稀释倍数 × 40。此公式适用于OD260读数在0.1至1.0的线性范围内。
RNA纯度通过特定波长吸光度比值进行评估：
OD260/OD280比值：理想值为1.9至2.1，表明RNA纯度良好。若比值低于1.9，提示可能存在蛋白质污染；若比值高于2.1，则提示RNA可能发生降解。
OD260/OD230比值：理想值应大于2.0。若比值低于2.0，提示可能存在盐离子、有机溶剂（如胍盐、酚、乙醇）等污染。
（三） RNA完整性评估
常用琼脂糖凝胶电泳进行直观评估。使用非变性或变性琼脂糖凝胶，上样并电泳后，使用核酸染料（如溴化乙锭或更安全的替代染料）进行染色观察。
高质量的总RNA电泳图谱应呈现三条清晰的核糖体RNA条带：真核生物样本通常可见28S、18S和5S rRNA。其中，28S rRNA条带的强度应约为18S rRNA条带的两倍，且所有条带边缘锐利，无明显拖尾现象。
若RNA严重降解，则表现为条带弥散或核糖体RNA特征条带消失。
若在加样孔内或孔附近观察到明亮的荧光条带，则提示可能存在基因组DNA污染。
三、注意事项与常见问题分析
（一）RNA无沉淀或得率低
1、样本处理不充分：组织或细胞匀浆不彻底时，高分子量的基因组DNA会与变性蛋白质结合形成黏稠的絮状复合物，将RNA包裹其中，阻碍其有效释放。同时，若样本起始量过低而裂解液体积相对过大，会导致RNA浓度过度稀释，异丙醇沉淀效率显著下降。
2、样本量与试剂比例失衡：样本量过多会降低匀浆效率，导致单位体积内DNA与蛋白质含量过高，进而影响RNA的释放以及后续的相分离效果，最终降低RNA沉淀得率。此外，TRIzol裂解液用量不足可能使裂解体系pH值偏离酸性范围（理想状态为pH 4.5-5.0），在此条件下DNA可能进入水相而非沉淀于界面，从而竞争性地影响RNA的沉淀效率。因此，需在保证提取量的前提下，确保裂解液足量。
3、操作细节问题：
👉吸取上层水相时若不慎混入中间层或下层有机相，会引入蛋白质、DNA及有机溶剂污染，影响后续沉淀。
👉裂解后室温静置时间不足5分钟，可能导致核蛋白复合物解离不完全。
👉沉淀后的RNA若未能完全溶解，也会导致实测得率偏低。
（二）RNA降解
RNA极易降解，需严格防控核糖核酸酶（RNase）污染并优化操作流程：
1、样本保存与状态：样本采集后应尽快处理，避免细胞生长过度或组织自溶。若无法立即提取，应于-80℃条件下保存。
2、实验环境与耗材：实验全程需佩戴手套，并确保所有接触样本的器材（如离心管、移液器吸头、工作台面等）均经过无RNase处理。
3、试剂污染：需确保所使用的氯仿、异丙醇、乙醇及无RNase水等试剂未被RNase污染。
4、操作过程：建议在低温环境下（如冰上）进行操作，并使用预冷的离心机。吸取水相时应谨慎操作，宁可牺牲少量上清液也要避免触及中间蛋白层，因残留的蛋白质可能含有RNase。使用75%乙醇洗涤RNA沉淀的步骤需执行到位，但洗涤时间不宜过长以减少RNA暴露于潜在风险的时间。
5、RNA保存：溶解后的RNA在溶液中呈酸性，易发生自发水解，应分装后于-70℃或更低温度下保存，并尽可能避免反复冻融。
（三）基因组DNA污染
👉裂解不充分：当裂解液用量不足或样本量过大时，可能导致裂解体系pH值不处于最佳酸性范围，致使部分DNA未能沉淀于界面而残留于水相。
👉操作引入：由于DNA分子量大，常与变性蛋白质结合存在于中间层。在转移水相时，应避免过度吸取，可保留紧邻中间层的少量水相，以最大限度减少DNA的共提取。
（四）RNA提取的技术挑战
1、RNA分子固有的不稳定性：RNA为单链分子，且核糖2‘-羟基的存在使其在化学上比DNA更易发生水解。
2、RNase的普遍性与高稳定性：RNase广泛存在于环境及生物样本中，且耐受高温及变性剂，灭活困难。
3、样本复杂性：某些样本类型中RNA丰度较低，或含有大量多糖、多酚、脂类等次生代谢产物，这些物质会干扰裂解、相分离及沉淀过程，降低RNA的提取效率与纯度。
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