一、ELISA 实验的基本原理
酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种基于抗原-抗体特异性结合反应，并通过酶标记物催化底物产生可检测信号，从而对样本中目标抗原或抗体进行定性与定量分析的免疫学技术。自 20 世纪 70 年代建立以来，该技术因其高灵敏度、强特异性、操作相对简便及便于高通量检测等特点，在生物医学研究、临床诊断及生物检测等多个领域获得广泛应用。
ELISA 的基本原理主要包含以下三个核心环节：
1、抗原-抗体的特异性识别与固相化
抗原与抗体的结合具有高度特异性，类似于“锁钥”机制，确保检测系统能够准确识别目标分子。实验通常首先将已知的抗原或抗体包被于聚苯乙烯微孔板等固相载体表面，使其固定化并保持免疫学活性。这一步骤便于后续反应液的分离与洗涤，减少非特异性干扰。
2、酶标记抗体的引入与结合
在待测样本与固相化抗原或抗体孵育并结合后，加入酶标记的抗体。酶标抗体是通过化学方法将酶与抗体偶联而成的复合物，兼具免疫结合活性与酶催化活性。它可与已形成的抗原-抗体复合物特异性结合，从而使一定量的酶固定在固相载体上。
3、酶促底物显色与信号检测
加入相应底物后，固相上的酶催化底物发生反应，生成有色产物。在适宜条件下，产物的颜色深浅与样本中目标抗原或抗体的含量呈正相关。通过分光光度计测定其吸光度值，即可实现对待测物的定性或定量分析。由于酶的高效催化作用，ELISA 的检测灵敏度可达皮摩尔级别，能够实现对微量目标物质的有效测定。
在实际应用中，双抗体夹心法是最常见的 ELISA 检测形式之一，主要用于大分子抗原的检测。该方法首先将捕获抗体包被于固相载体，加入样本使目标抗原与捕获抗体结合；随后加入酶标记的检测抗体，该抗体识别抗原的另一表位，最终形成“捕获抗体-抗原-酶标检测抗体”的夹心复合物。经过洗涤去除未结合物质，加入底物显色后，依据显色强度即可推算出目标抗原的浓度。该设计通过两次特异性免疫反应，显著提高了检测的灵敏度与特异性，并有效降低了非特异性信号的干扰，已广泛应用于肝炎病毒标志物、肿瘤标志物及激素等多种物质的检测中。
二、ELISA 实验的应用领域
酶联免疫吸附实验（ELISA）凭借其高灵敏度、强特异性以及易于标准化与高通量操作的技术优势，在多个重要领域中发挥着关键作用，为科学研究、临床诊疗及公共健康监测提供了强有力的技术支撑。
1. 医学诊断与疾病监测
ELISA 是临床免疫学检测的核心技术之一。在传染病诊断方面，该技术广泛应用于病原体特异性抗体或抗原的检测。例如，在病毒性肝炎、人类免疫缺陷病毒感染等重大传染病的早期筛查与诊断中，ELISA 可实现对血清标志物的准确测定，为流行病学调查、患者管理及防控策略制定提供关键依据。在肿瘤学领域，ELISA 可用于定量检测甲胎蛋白、癌胚抗原、糖类抗原等多种肿瘤标志物，辅助恶性肿瘤的早期发现、疗效评估及预后监测。此外，该技术也是自身免疫性疾病诊断的重要工具，通过检测患者血清中的各类自身抗体（如抗核抗体、抗双链DNA抗体等），为疾病分型与活动度判断提供实验室证据。
2. 生命科学研究
在基础与转化生物医学研究中，ELISA 是不可或缺的分析手段。该技术常用于定量检测生物样本（如细胞培养上清、组织匀浆、血清）中的细胞因子（如白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子）、生长因子及信号分子等，从而深入探究免疫调节、细胞通讯、炎症反应等生物学过程的分子机制。在蛋白质组学与功能研究中，ELISA 可用于特定蛋白的表达水平测定及翻译后修饰分析。在药物研发领域，ELISA 被用于评估候选药物的药理活性、靶点结合效率及潜在的免疫原性，并在临床前与临床研究中监测与药物疗效或安全性相关的生物标志物动态变化。
3. 食品安全检测
ELISA 在食品安全监控体系中扮演着重要角色。该技术能快速、灵敏地检测食品及农产品中的各类有害残留物，包括农药（如有机磷类）、兽药（如抗生素、激素）以及生物毒素（如黄曲霉毒素）等，为保障食品原料与成品的质量安全提供高效的筛查手段。同时，ELISA 也应用于食品中常见过敏原（如花生蛋白、麸质）的检测，以预防食源性过敏反应的发生。
4. 环境监测与公共卫生
在环境科学领域，ELISA 被用于监测多种环境介质中的污染物与生物因子。在水质监测中，可检测水体中的微量农药、重金属离子以及特定病原微生物的抗原标志物。在土壤监测方面，该技术有助于评估农药残留及特定微生物污染状况。此外，ELISA 还能用于检测空气样本中的过敏原（如花粉、尘螨抗原）或特定微生物组分，为环境健康风险评估与污染控制提供数据支持。
三、ELISA 实验的操作步骤详解
酶联免疫吸附实验（ELISA）的操作需遵循标准化的流程，以确保结果的准确性、可重复性。以下以常见的双抗体夹心法为例，详细阐述其主要步骤与注意事项。
（一）样本前处理
待测样本的质量直接影响检测结果，需根据样本类型进行标准化前处理：
👉细胞培养上清：收集细胞培养液后，建议在低温（如 4℃）条件下以 800-1000 × g 离心 5-10 分钟，取上清液分装保存于 -80℃，以去除细胞碎片。
👉血清样本：血液采集后，应使用不含抗凝剂的采血管，室温静置 30-60 分钟使其充分凝固，随后在 4℃ 条件下以 1500-2000 × g 离心 10-15 分钟，谨慎吸取上层澄清的血清，避免吸入红细胞或凝块。
👉血浆样本：使用含适宜抗凝剂（如 EDTA、肝素）的采血管收集血液，轻柔混匀后立即在 4℃ 条件下以 1500-2000 × g 离心 10-15 分钟，尽快分离上层血浆。
所有样本处理过程应避免反复冻融，并在检测前根据预实验确定合适的稀释倍数。
（二）实验准备
实验前需备齐所有材料与试剂：
✔️仪器设备：主要包括可调式移液器及配套吸头、聚苯乙烯微孔板、酶标仪、洗板机或手动洗板装置、恒温孵育箱、计时器等。
✔️试剂准备：若使用商品化试剂盒，应仔细阅读说明书，提前将所需试剂（如捕获抗体、检测抗体、酶结合物、底物溶液、终止液、标准品、稀释液及洗涤缓冲液）平衡至室温，并按说明书要求进行配制。
（三）包被
将经稀释的捕获抗体溶液按预定体积（通常为 100 μL/孔）加入微孔板中，使用封板膜密封后，置于 4℃ 孵育过夜。孵育结束后，弃去孔内液体，使用洗涤缓冲液充分洗涤微孔板 3-5 次，以去除未结合的抗体，每次洗涤后应在吸水材料上拍干残留液体。
（四）封闭
为减少非特异性结合，需向每孔中加入封闭缓冲液（常用含 1-5% BSA 或脱脂奶粉的缓冲液），于 37℃ 孵育 1-2 小时。孵育后，再次进行彻底的洗涤。
（五）加样与孵育
将稀释好的待测样本、系列浓度标准品及阴性/阳性对照品按序加入相应的微孔中。加样时应避免产生气泡。加样完成后密封微孔板，置于 37℃ 孵育 1-2 小时，使目标抗原与固相抗体充分结合。孵育结束后，彻底洗涤 3-5 次。
（六）加检测抗体孵育
向每孔中加入经稀释的酶标记检测抗体工作液，密封后于 37℃ 避光孵育 1 小时。孵育完成后，再次进行洗涤以去除非特异性结合的酶标抗体。
（七）加酶结合物孵育
若使用非直接酶标检测抗体（如生物素-链霉亲和素系统），此步骤需加入相应酶标记的链霉亲和素，并再次进行孵育与洗涤。
（八）显色反应
洗涤后，立即向每孔中加入新鲜配制的底物溶液（如 TMB），室温下避光显色一段时间（通常 10-30 分钟），密切观察显色情况。
（九）终止与测定
当标准品孔出现明显的梯度显色或阳性对照孔显色适当时，及时向每孔中加入终止液（如硫酸溶液）以终止酶促反应。混匀后，立即使用酶标仪在特定波长（如 TMB 为 450 nm，参比波长 630 nm）下测定各孔的吸光度值。
（十）数据分析
首先计算标准品与样品孔吸光度的复孔均值。以标准品浓度为横坐标，其对应的吸光度均值为纵坐标，绘制标准曲线（通常采用四参数 logistic 曲线拟合）。根据样品的吸光度均值，通过标准曲线计算出其对应的浓度，再乘以样本的稀释倍数，即可得到样本中目标抗原的实际浓度。所有数据处理应遵循严格的实验室质量控制规范。
四、ELISA实验的注意事项
为确保酶联免疫吸附实验（ELISA）结果的准确性、重复性与可靠性，实验过程中需对样本处理、操作流程及质量控制等环节予以严格规范。以下是关键注意事项的系统阐述。
（一）样本处理与保存的规范
样本质量是决定检测成功与否的基础，必须遵循标准前处理流程。
1、血液样本处理：采集血液样本时需使用正确的采血管。制备血清样本应避免剧烈振荡或冻融，以防止溶血发生，溶血释放的内源性物质可能干扰后续的抗原-抗体反应或酶促显色过程。制备血浆时则需确保抗凝剂使用得当并充分混匀。离心分离血清或血浆后，应仔细吸取上清，避免吸入底层细胞、纤维蛋白凝块或脂质层。
2、样本保存：制备后的样本如不能立即检测，应分装并于低温条件下保存（短期可置于-20℃，长期建议-80℃保存），以最大程度减少目标蛋白的降解。实验前应规划好样本使用量，尽量避免反复冻融，因反复冻融易导致蛋白质变性或聚集，影响检测结果。
3、样本性状要求：用于检测的样本应尽可能澄清、无可见悬浮物或沉淀。若样本出现浑浊、严重溶血、高脂血或有微生物污染迹象，可能对检测产生非特异性干扰，需评估其适用性或进行必要的前处理（如高速离心、过滤等）。
（二）关键操作环节的质量控制
实验操作的精确性与一致性直接影响数据的可信度。
👉洗涤步骤：洗涤是去除未结合物质、降低背景信号的关键步骤。无论是手动还是使用洗板机洗涤，必须确保每孔加液充足、浸泡时间足够，并彻底弃去洗涤液。手动拍干时，需使用洁净的吸水材料，力度均匀，避免产生气溶胶或交叉污染。使用洗板机应定期校准和维护，确保喷液与吸液功能正常。
👉加样与孵育：使用校准过的移液器精确加样，避免产生气泡。样本、标准品及试剂应按预定顺序加入。孵育过程中，微孔板需用封板膜密封并置于水平、温度均匀的孵育箱内，防止蒸发和边缘效应。
👉显色与终止：显色反应需在避光条件下进行，并严格控制反应时间。终止反应时应确保终止液添加充分并立即混匀。终止后建议在规定时间内完成读数。
（三）数据判读与结果分析
✔️复孔设置与接受标准：建议所有样本和标准品均设置复孔（至少双复孔），以评估操作的重复性。通常，复孔间吸光度值的变异系数应小于20%，若差异过大，则提示操作可能存在误差，该数据应谨慎对待或重新实验。
✔️标准曲线的建立与使用：每次实验都必须随行制备新鲜的标准曲线。标准品的浓度范围应涵盖待测样本的可能浓度。绘制标准曲线后，需评估其拟合度（如R²值）。样品的吸光度值应落于标准曲线的线性范围内。若样品值超出上限，则需适当稀释后重新检测，最终浓度计算需乘以相应的稀释倍数。
✔️背景扣除与质控：应设置空白对照孔（仅含检测试剂）以校正背景吸光度。同时，包括阳性与阴性对照在内的质控样本结果应符合预期，这是判断本次实验是否有效的重要依据。任何偏离预期的质控结果均提示实验过程可能存在问题，所得数据不可信。
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