一、引言

   蛋白质作为生命活动的主要执行者，其功能的实现往往依赖于与其他蛋白质之间形成的动态相互作用网络。传统的蛋白互作检测方法，如免疫共沉淀、酵母双杂交等，虽能鉴定互作关系，但通常丧失细胞或组织原位空间信息。空间蛋白互作分析技术的出现，为在组织原位解析蛋白质复合物的定位与分布提供了可能。邻位连接技术（Proximity Ligation Assay, PLA）作为一种高灵敏度与高特异性方法，能够在完整细胞或组织切片上实现单个蛋白质互作事件的可视化检测与定量分析。本文旨在系统阐述基于邻位连接技术的空间蛋白互作检测的实验流程与技术要点。

 二、实验原理概述

   邻位连接技术的核心原理在于利用一对分别识别两个目标蛋白的特异性一抗，并配合携带寡核苷酸链的二抗（即PLA探针）。当两个目标蛋白在空间上的距离小于40纳米时，两种PLA探针上的寡核苷酸链能够通过随后加入的连接环状DNA模板进行邻近连接。连接后的DNA环可作为滚环扩增的模板，在DNA聚合酶作用下生成一个长约数百纳米的单链DNA产物。该产物可通过标记的互补寡核苷酸检测探针进行可视化，从而在荧光显微镜下呈现为一个个离散的荧光斑点。每个斑点代表一个蛋白质互作事件或复合物，实现了对互作事件的单分子水平检测与空间定位。

 三、主要实验材料与试剂准备

 3.1 样本制备相关材料

   实验样本可为贴壁培养细胞、细胞悬液涂片或石蜡包埋组织切片。对于石蜡切片，需预先进行脱蜡与水化处理；对于冰冻切片或细胞样本，则需进行固定以维持细胞形态并保留抗原性。常用固定剂为4%多聚甲醛，固定时间根据样本类型而定，通常为10至30分钟。

 3.2 抗体与PLA探针

   实验需选择两种不同物种来源的一抗，分别靶向目标蛋白。与之配套的PLA探针为分别偶联有互补寡核苷酸链的种属特异性二抗。探针的选择需与一抗的物种来源严格对应。此外，还需准备连接缓冲液、连接酶、扩增缓冲液、聚合酶以及荧光标记的检测探针。

 四、核心实验操作步骤

 4.1 样本预处理与封闭

   将制备好的细胞爬片或组织切片置于湿盒内，使用含血清或牛血清白蛋白的封闭液进行孵育。封闭步骤旨在减少抗体的非特异性结合，降低背景信号。封闭条件通常为37摄氏度恒温孵育30分钟至1小时。

 4.2 一抗共孵育

   移除封闭液后，在样本表面滴加经优化稀释后的两种一抗混合工作液。确保抗体工作液完全覆盖样本区域，置于4摄氏度孵育过夜或37摄氏度孵育1至2小时。孵育结束后，使用洗涤缓冲液充分漂洗，移除未结合的一抗。

 4.3 PLA探针孵育与连接

   滴加PLA探针工作液，在37摄氏度条件下孵育1小时。此步骤使二抗与一抗特异性结合。孵育后再次洗涤，随后加入连接缓冲液（包含环状连接模板与连接酶），置于37摄氏度孵育30分钟。若两个PLA探针足够靠近，连接酶将催化两个探针上的寡核苷酸链与中间模板连接，形成闭合环状DNA分子。

 4.4 滚环扩增反应

   移除连接液并洗涤后，滴加扩增缓冲液（含核苷酸、DNA聚合酶及荧光标记的检测探针）。将样本置于37摄氏度避光孵育100分钟。在此过程中，聚合酶以环状DNA为模板不断延伸，生成一条长链重复序列的DNA产物。同时，荧光标记的检测探针与扩增产物的互补序列杂交，使产物带上荧光标记。

 4.5 封片与成像

   扩增结束后，移除反应液并彻底洗涤，以降低背景。待样本自然晾干后，使用含DAPI的封片剂进行封片，以标记细胞核。封片后的样本可在共聚焦显微镜或荧光显微镜下进行图像采集。每个PLA信号呈现为明亮的点状结构，需使用高倍物镜进行观察与拍摄。

 五、结果分析与数据解读

   图像采集后，需对PLA信号点进行定量分析。通常选取多个不重叠的视野，使用图像分析软件统计每个细胞的信号点数量。信号点的多少直接反映蛋白互作的强度或频率。在数据解读时，需设置严格的对照组以验证信号的特异性，包括仅使用单一种类一抗的阴性对照、已知不表达目标蛋白的样本对照以及仅加PLA探针不加一抗的空白对照。通过比较实验组与对照组的信号点密度，可判断蛋白互作的特异性与相对水平。

 六、实验关键点与常见问题

 6.1 抗体选择与验证

   该技术的成败高度依赖一抗的特异性与亲和力。建议优先选择已验证适用于免疫组化或免疫荧光的抗体。一抗的稀释比例需通过预实验进行优化，过高易产生非特异性信号，过低则导致信号丢失。

 6.2 样本固定与通透

   固定过度会遮蔽抗原表位，固定不足则可能导致细胞结构破坏。对于核内蛋白互作检测，需在固定后增加通透步骤，常用0.1%至0.5%的Triton X-100处理10分钟，以利于抗体进入细胞核。

 6.3 洗涤条件的控制

   整个实验流程包含多次洗涤，其目的在于去除未结合试剂，降低背景。洗涤不充分会导致背景增高，而洗涤过于剧烈则可能导致细胞脱落。应根据样本类型调整洗涤缓冲液的盐离子浓度与表面活性剂含量。

 七、结语

   空间蛋白互作分析技术通过巧妙的分子设计，将免疫识别的特异性与核酸扩增的高灵敏度相结合，实现了在组织原位对蛋白质复合物的高分辨率检测。该方法不仅能够揭示蛋白质相互作用的亚细胞定位，还能通过定量分析比较不同生理或病理状态下的互作变化。随着抗体资源的日益丰富和检测通量的提升，该技术将在信号转导机制研究、疾病标志物筛选及药物靶点验证等领域展现出更广阔的应用前景。

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