摘要

                  

细胞迁移与侵袭是生物体内重要的生理和病理过程，尤其在肿瘤恶性进展中发挥关键作用。细胞迁移/侵袭实验是评估细胞运动能力的核心体外技术，为肿瘤学等领域的机制研究和干预效果评价提供重要实验依据。本文系统阐述细胞迁移与侵袭的生物学基础，详细介绍细胞划痕实验和Transwell小室检测两种主流实验方法的原理、操作流程、优缺点，并总结实验操作中的关键注意事项与优化策略，旨在为相关领域的科研工作提供标准化的实验参考。

                                 

一、细胞迁移与侵袭的生物学基础

                    

细胞迁移是活细胞普遍存在的运动形式，指细胞接收迁移信号或感知物质浓度梯度后，通过头部伪足延伸、新黏附建立、细胞体尾部收缩的时空交替过程实现移动，是胚胎发育、血管生成、伤口愈合等正常生理过程的核心环节，同时也是肿瘤转移的关键步骤。转移性疾病是导致癌症患者死亡的主要原因，因此解析细胞迁移机制成为肿瘤研究的重要方向。

                        

细胞侵袭是细胞迁移的特殊形式，与肿瘤的恶性浸润密切相关，指细胞在原位突破基底膜，通过分泌蛋白酶降解胞外基质（ECM）或基底膜基质层（BME），进而内渗进入血管、淋巴管并侵入新组织区域的过程。细胞侵袭不仅参与伤口修复、血管形成等生理过程，更在肿瘤细胞的远处转移中起决定性作用，其能力评估是肿瘤相关信号通路研究、靶向药物筛选的重要指标。

                          

目前检测细胞迁移能力的主流方法为细胞划痕实验和Transwell小室检测，前者模拟单层细胞的2D平面迁移，后者可实现3D空间的迁移与侵袭能力检测，其中Transwell小室检测也是评估细胞侵袭能力的最常用手段。

                                                         

二、细胞划痕实验

                  

细胞划痕实验又称伤口愈合实验，是模拟体内细胞迁移的经典2D体外实验方法，因操作简便、成本低廉成为细胞迁移能力初筛的首选技术。

                                            

                                   

划痕实验示意图

Hulkower KI, Herber RL. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 2011 Mar 11;3(1):107-24.

                                  

（一）实验原理

                         

当培养的贴壁细胞融合成单层后，通过人工手段在细胞层制造无细胞的空白区域（划痕），划痕边缘的细胞会在趋化信号作用下逐渐向空白区域迁移，使划痕逐渐愈合，通过观察不同时间点划痕的愈合程度，可定量评估细胞的迁移能力。

                             

（二）操作流程

                         

实验全程遵循无菌操作原则，核心步骤为：

                       

①培养板划线：在6孔板背面用马克笔绘制等距横线，作为后续观察的定位标记；

                         

②铺板：将对数生长期的细胞接种至6孔板，培养至细胞融合度达90%以上；

                            

③细胞划线：用无菌枪头沿培养板背面横线垂直划线，制造均匀划痕；

                  

④清洗：用无血清培养基轻轻冲洗培养板2~3次，去除划落的细胞；

                   

⑤细胞培养观察：加入无血清或低血清培养基，置于培养箱中培养，在设定时间点观察并拍照；

                  

⑥结果分析：通过图像分析软件测量划痕宽度，计算划痕愈合率。

                

（三）实验要点

                   

1. 培养板选择：常规实验优先选用6孔板，其定位线可提供10个固定监测点，减少实验误差；高通量初筛时可选用12孔板或24孔板。

                   

2. 细胞接种：根据细胞贴壁率和生长速度调整接种浓度，保证实验终止时细胞密度适宜，避免过度增殖影响结果。

                 

3. 培养基选择：采用无血清或血清浓度≤2%的培养基进行培养，降低细胞增殖对迁移实验的干扰。

                        

（四）优缺点

                 

优点：

                 

①操作简便，无需特殊实验仪器；

              

②实验成本低，适合大批量样本的初筛；

                    

③实验周期短，可快速获得结果。

                

缺点：

                  

①手工划痕易出现宽度不均一，影响愈合度的准确评估；

                   

②划线过程会对划痕周围细胞造成机械损伤，降低细胞活性；

                  

③难以完全排除细胞增殖对实验结果的干扰，无法单独反映细胞的纯迁移能力。

                       

三、Transwell小室检测

                     

Transwell小室检测是基于微孔滤膜的细胞迁移与侵袭检测技术，可模拟细胞在体内3D微环境中的运动过程，既能检测细胞迁移能力，也是评估细胞侵袭能力的金标准，广泛应用于肿瘤学的深入研究。

               

                                 

Transwell实验原理图

                            

（一）实验原理

                  

将Transwell小室放入培养板中，小室为上室，培养板孔为下室，上下室通过带有微孔的聚碳酸酯膜分隔。上室加入含待检测细胞的无血清培养基，下室加入含血清或趋化因子的完全培养基，利用营养梯度诱导细胞发生跨膜运动。通过对滤膜下表面的细胞进行染色计数，可定量判断细胞的迁移或侵袭能力；当检测侵袭能力时，需在滤膜上表面铺覆一层基质胶模拟体内ECM，细胞需先降解基质胶才能完成跨膜运动，更贴合体内肿瘤细胞的侵袭过程。

                      

（二）实验分类及应用

                   

根据滤膜孔径和处理方式的不同，Transwell小室检测可应用于多种研究场景，核心应用包括：

                     

1. 共培养体系：选用孔径＜3.0μm的滤膜，细胞无法穿膜，可将细胞A种于上室、细胞B种于下室，研究细胞B的分泌产物对细胞A的生物学影响。

                  

2. 趋化性实验：选用适宜孔径的滤膜，通过计数下室细胞量，可分析细胞B分泌产物或外源性趋化因子对目标细胞的趋化作用。

                      

3. 肿瘤细胞迁移实验：上室接种肿瘤细胞，下室加入胎牛血清（FBS）或特定趋化因子，通过跨膜细胞数反映肿瘤细胞的迁移能力。

                       

4. 肿瘤细胞侵袭实验：在迁移实验的基础上，于上室滤膜表面铺覆Matrigel基质胶，细胞需分泌基质金属蛋白酶（MMPs）降解基质胶后才能跨膜，跨膜细胞数可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

                  

（三）操作流程

                        

1. 细胞迁移实验流程

                         

①细胞培养与处理：将目标细胞培养至对数生长期，根据实验设计进行药物处理、基因修饰等干预；

                     

②Transwell小室准备：将小室放入24孔板中，无菌条件下平衡滤膜；

                  

③制备细胞悬液：用无血清培养基重悬细胞，调整细胞浓度至适宜范围；

               

④接种细胞：将细胞悬液加入上室，下室加入完全培养基，置于培养箱培养；

                   

⑤细胞固定：培养结束后，取出小室，用多聚甲醛固定滤膜上的细胞；

                     

⑥细胞染色：用结晶紫等染料对固定后的细胞进行染色；

                 

⑦封片与计数：擦去滤膜上表面未迁移的细胞，封片后在显微镜下观察并计数下表面的细胞数。

                    

2. 细胞侵袭实验流程

            

与迁移实验相比，侵袭实验需增加包被基底膜和水化基底膜两个步骤：在细胞接种前，用Matrigel基质胶稀释液均匀包被滤膜上表面，置于培养箱中孵育形成凝胶层；随后用无血清培养基水化凝胶层，其余步骤与迁移实验一致。

                     

（四）实验要点

                 

1. 细胞状态：实验所用细胞需处于对数生长期，状态良好，避免细胞凋亡或衰老影响实验结果。

                 

2. 气泡排除：放置小室时轻缓操作，避免滤膜下产生气泡，若出现气泡可轻拍底板侧面清除。

               

3. 细胞清理：固定后擦去滤膜上表面未迁移细胞时，需控制棉签力度，避免戳破滤膜或擦除下表面的跨膜细胞。 4. 细胞处理：对于穿膜能力较弱的细胞，可提前进行饥饿处理，增强细胞的趋化运动能力。

                      

四、实验操作的通用注意事项与优化策略

                      

细胞迁移与侵袭实验的结果易受操作细节影响，为保证实验的重复性和准确性，需遵循以下通用注意事项，并采用相应的优化策略：

           

1. 实验器具消毒：直尺、马克笔、枪头等实验器具使用前需经紫外照射消毒，避免微生物污染。

                   

2. 细胞铺板标准化：根据细胞生长速度调整接种数量，保证每组细胞铺板密度一致且铺匀，减少组间误差。 

                    

3. 划痕操作优化：划线前保留原培养基，避免划落的细胞团块堆积在划痕边缘；用枪头划线时用力均匀、垂直稳定，保证划痕宽度一致；亦可使用culture Insert模具替代手工划痕，获得无细胞损伤的笔直划痕。

                

4. 定位观察与拍照：利用培养板定位线的交叉点作为固定监测点，0h拍照时标记位置，后续在相同位置观察拍照；拍照时避免露出马克笔线条，保证镜头清晰，切换镜头时及时更换标尺，便于后续图像分析。

                  

5. 细胞增殖干扰排除：除使用无血清/低血清培养基外，可采用1μg/ml丝裂霉素处理细胞1h，抑制细胞分裂；需注意丝裂霉素可能会降低细胞迁移速度，实验中需设置对照。

                      

6. 观察时间点选择：常规观察时间点为0、2、4、6、8、12、24h，不建议超过24h，避免细胞过度增殖造成实验假阳性。

                     

7. 结果分析优化：采用长度法分析划痕实验结果时，由于细胞迁移并非齐头并进，需测量多条距离并取平均值，提高结果的准确性；Transwell实验需在显微镜下随机选取多个视野计数，取平均值作为最终结果。

                              

五、实验应用与展望

                    

细胞迁移与侵袭实验作为体外评估细胞运动能力的核心技术，已广泛应用于肿瘤学、细胞生物学、药理学等多个领域，尤其在肿瘤研究中，可用于评估基因修饰（过表达、敲低、敲除、点突变）、药物处理等干预手段对肿瘤细胞恶性表型的影响，为肿瘤靶向药物的筛选和作用机制研究提供重要实验数据。 随着实验技术的不断发展，细胞迁移与侵袭实验也在向标准化、精准化方向升级，如自动化划痕仪的应用解决了手工划痕的不均一问题，3D培养体系的结合使实验更贴近体内生理微环境。未来，结合单细胞测序、活细胞成像等技术，将进一步解析细胞迁移与侵袭的分子机制，为肿瘤转移的临床干预提供更精准的实验依据。

                                             

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