一、引言

基因组稳定性是维持细胞正常生理功能与抑制疾病发生的核心基础，外源性理化因素（辐射、化学毒物、药物）与内源性应激（氧化应激、复制压力）均可诱发DNA链断裂、碱基损伤等基因组损伤。传统DNA损伤检测方法多基于群体细胞平均水平，难以捕捉单细胞层面的异质性损伤信息。 彗星电泳技术自1984年提出并经Singh等改良后，凭借单细胞分辨率、高灵敏度、样本量小、无需放射性标记、操作简便等优势，成为国际公认的DNA损伤评估“金标准”之一，广泛用于遗传毒性筛选、环境生物监测、临床疾病机制研究等领域。

二、实验原理

彗星电泳基于凝胶电泳分子分离与DNA解链特性：

（1）单细胞包埋于薄层琼脂糖凝胶，经高盐裂解液去除细胞膜与蛋白质，释放核DNA形成类核体；

（2）碱性电泳缓冲液（pH>13）使DNA双链解旋，断裂的DNA片段带负电，在电场中向阳极迁移；

（3）完整DNA分子量大、迁移慢，形成致密彗星头部；断裂片段小、迁移快，形成弥散彗星尾部；

（4）荧光染色后通过显微镜观察与图像分析，以尾长、尾DNA百分比、尾矩、Olive尾矩定量DNA损伤程度：损伤越重，尾部越长、荧光强度越高、尾部DNA占比越大。 该技术可检测单链断裂、双链断裂、碱性不稳定位点、修复中间体，覆盖绝大多数可导致基因组不稳定的DNA损伤类型。  

三、材料与方法  

（一）主要试剂与仪器

- 试剂：正常熔点琼脂糖（NMPA）、低熔点琼脂糖（LMPA）、细胞裂解液、碱性电泳缓冲液（300 mM NaOH、1 mM Na₂EDTA，pH>13）、0.4 M TrisHCl中和液（pH 7.5）、PI染色液、PBS缓冲液。

- 仪器：水平电泳槽、恒温水浴锅、荧光显微镜、细胞计数板、低温离心机、载玻片/盖玻片。  

（二）标准化操作步骤

（1）细胞制备：培养细胞生长至80%–90%汇合度，胰酶消化后PBS洗涤，计数并调整浓度至100个/μL，全程冰上操作。

（2）载玻片预处理：0.5% NMPA（PBS配制）煮沸溶解，载玻片浸胶后擦去背面胶层，60℃烘干过夜，室温保存备用。

（3）双层凝胶包埋

- 第一层：预处理载玻片为基底胶，增强附着力；

- 第二层：37℃预热0.5% LMPA，取100 μL胶与10 μL细胞悬液混匀，铺于第一层胶，加盖玻片轻压，4℃固化1–3 min（避免过长导致脱胶）。

                 

（4）细胞裂解：玻片浸入预冷裂解液，4℃避光裂解2h，彻底去除蛋白与膜结构。

（5）碱化与电泳：玻片置于电泳槽阳极侧，加入冰冷碱性缓冲液浸没胶面2 mm，避光碱化15 min；设置25 V、300 mA，电泳20 min，使断裂DNA充分迁移。

（6）中和：TrisHCl中和液浸洗3次，每次5 min，恢复中性环境以稳定DNA结构。

（7）染色与观察：晾干后滴加20–50 μL PI染液，避光染色；荧光显微镜镜检，每样本随机计数≥100个细胞，用CASP/CometScore软件定量分析彗星参数。  

（三）关键质控与注意事项

- 全程避光：除中和与染色外，所有步骤避光操作，防止光致DNA损伤干扰结果。

- 防脱胶：确保基底胶均匀干燥，第二层胶固化时间严格控制，避免凝胶脱落导致实验失败。 - 样本保存：中和后未立即检测的玻片可经无水乙醇脱水、晾干避光保存，可稳定3个月，临用前复染。

- 定量原则：以尾DNA百分比（%Tail DNA）为首选参数，稳定性与重复性最优；尾长、尾矩作为辅助指标。  

四、结果判读

- 正常细胞：DNA完整，仅见圆形明亮头部，无明显尾部；

- 轻度损伤：尾部短、荧光弱，尾DNA占比低；

- 重度损伤：尾部显著延长、荧光强，头部信号减弱，呈典型“彗星”形态；

- 极重度损伤/凋亡：头部几乎消失，尾部呈弥散“刺猬状”，提示基因组广泛崩解。  

五、技术优势与应用领域  

（一）核心优势

（1）单细胞分辨率：揭示细胞间损伤异质性，适合微量样本与原代细胞检测；

（2）高灵敏度：可检测低至单个细胞几个DNA链断裂，远优于传统琼脂糖凝胶电泳；

（3）广谱适用：适用于真核细胞（哺乳细胞、植物细胞、酵母等），无需转基因或抗体；

（4）低成本高效：单日可完成多组样本，适合高通量初筛。  

（二）主要科研应用

（1）遗传毒性评价：药物、化妆品、食品添加剂、环境化合物的DNA损伤安全性筛选，为法规申报提供关键数据；

（2）环境生物监测：检测水体、土壤、大气污染物对生物的遗传毒性，评估环境健康风险；

（3）DNA修复机制研究：结合修复酶抑制剂或基因敲低，解析修复通路功能与动力学；

（4）临床转化研究：肿瘤放化疗敏感性评估、退行性疾病、衰老机制、职业暴露人群生物监测、精子DNA碎片检测；

（5）抗氧化/保护剂筛选：评价天然产物、营养素对DNA损伤的干预与保护效果。  

六、讨论与展望

彗星电泳是DNA损伤研究的基础核心技术，但操作细节对重复性影响显著：制胶均匀度、裂解时间、电泳电压/时间、染色浓度均为关键变量。建议实验室建立标准化SOP，设置H₂O₂阳性对照与空白对照，确保数据可靠。

七、结论

碱性彗星电泳是灵敏、可靠、低成本的单细胞 DNA 损伤检测技术，可定量评估 DNA 链断裂与修复动态，覆盖遗传毒理、环境监测、药物研发、基础医学等多场景应用。严格执行标准化操作与质控，可获得稳定、可重复的定量数据，为基因组稳定性与疾病机制研究提供强有力支撑。

乐备实（上海优宁维生物科技股份有限公司旗下全资子公司），是国内专注于提供高质量蛋白检测以及组学分析服务的实验服务专家，自2018年成立以来，乐备实不断寻求突破，公司的服务技术平台已扩展到单细胞测序、空间多组学、流式检测、超敏电化学发光、Luminex多因子检测、抗体芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫组化、DSP空间多组学等30多个，建立起了一套涵盖基因、蛋白、细胞以及组织水平实验的完整检测体系。

 
我们可提供从样本运输、储存管理、样本制备、样本检测到检测数据分析的全流程服务。凭借严格的实验室管理流程、标准化实验室操作、原始数据储存体系以及实验项目管理系统，已经为超过3000家客户单位提供服务，年检测样本超过100万，受到了广大客户的信任与支持。