标 题：CD160 dictates anti-PD-1 immunotherapy resistance by regulating CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer
影 响 因 子：IF=19.1
发 表 时 间：2025年9月9日
发 表 期 刊：《Nature Cell Biology》
发 表 单 位：哈尔滨医科大学国家卫生健康委分子探针与靶向诊疗重点实验室、中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所
一、研究背景
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球发病率极高的消化道恶性肿瘤，严重威胁人类生命健康。临床解剖与组织学研究发现，空肠与结肠在组织结构、转录组特征及解剖毗邻关系上具有高度相似性，但二者肿瘤发生风险存在显著差异，结肠癌变发生率远高于空肠，目前介导这一差异的核心分子机制尚未明确。在CRC临床免疫治疗领域，抗PD-1抗体已成为微卫星高度不稳定（MSI-H）型CRC的核心治疗方案，可显著改善部分患者预后，但近半数MSI-H患者会出现原发性或继发性耐药，极大限制了免疫治疗的整体疗效。
CD160是主要表达于淋巴细胞表面的关键膜分子，在肠道上皮内淋巴细胞（intraepithelial lymphocytes, IEL）中呈特异性高表达。现有研究多聚焦于CD160的基础免疫表达特征，但其在CRC肿瘤免疫微环境中的具体调控功能、对肠道T细胞免疫稳态的影响，以及是否参与介导抗PD-1免疫耐药，目前尚无明确研究报道。
二、实验设计
该研究以健康人群、CRC患者的空肠、结肠及肿瘤组织样本为研究对象，通过多组学联合分析对比肠道不同节段的免疫生态差异，筛选核心差异免疫分子及细胞亚群，重点聚焦CD160⁺CD8⁺T细胞的生物学特征与功能机制。通过临床样本分析、多维度体外细胞实验、小鼠体内功能验证及机制探究，逐层解析CD160在CRC免疫调控中的核心作用。
人群样本多组学分析结果证实，空肠组织特异性富集CD160⁺CD8⁺T细胞，该细胞亚群具备抵抗T细胞终末耗竭、高效克隆扩增的优势特征。体内功能实验显示，过继回输CD160⁺CD8⁺T细胞可显著抑制MSI-H型CRC及炎症诱导型CRC的肿瘤增殖；而Cd160基因敲除会显著加速肿瘤进展，且该促癌表型可通过外源回输CD160⁺CD8⁺T细胞有效逆转。更重要的是，在MSI-H CRC及抗PD-1耐药模型中，CD160⁺CD8⁺T细胞可显著增敏抗PD-1免疫治疗、逆转耐药表型，通过富集肿瘤微环境中的前体耗竭T细胞，实现肿瘤病灶的有效清除。
机制层面，CD160可直接结合PI3K调节亚基p85α，激活下游AKT–NF-κB信号通路，进而上调T细胞表面FcεR1γ与4-1BB的表达，最终显著增强CD8⁺T细胞的肿瘤杀伤毒性。综上，该研究明确了CD160是调控CD8⁺T细胞功能稳态的关键分子，证实CD160⁺CD8⁺T细胞过继转移是攻克CRC抗PD-1耐药的创新免疫治疗策略，为CRC精准免疫治疗提供了全新理论依据。
三、实验方法与结果
3.1 空肠与结肠组织的免疫生态特征差异
为揭示空肠、结肠癌变风险差异的免疫学机制，该研究收集健康人群与CRC患者的回肠、结肠及肿瘤组织样本，整合单细胞转录组测序（scRNA-seq）、单细胞TCR测序（scTCR-seq）、单细胞BCR测序（scBCR-seq）技术，系统性构建肠道不同节段及CRC肿瘤组织的免疫细胞全景图谱。
测序结果显示，回肠组织中特异性富集高表达CD160的CD8⁺T细胞亚群，该细胞亚群免疫活化活性更强、细胞耗竭水平显著更低；反观结肠正常组织及CRC肿瘤组织中，CD160⁺CD8⁺T细胞的浸润数量显著减少。进一步临床预后分析表明，肿瘤免疫特征趋近于回肠免疫微环境的“回肠型”CRC患者，整体预后显著优于其他亚型患者。上述结果证实，回肠组织具备更强的抗肿瘤免疫活性与杀伤潜能，而CD160⁺CD8⁺T细胞是维持肠道强效抗肿瘤免疫微环境的核心标志性细胞。
3.2 CD160精准界定CD8⁺T细胞耗竭动态轨迹
持续性肿瘤抗原刺激会诱导T细胞从活化状态逐步向前体耗竭（TPex） 、终末耗竭（TTex） 状态动态转化，是导致肿瘤免疫逃逸、免疫治疗失效的核心原因。该研究通过多维度细胞亚群分型分析，精准解析了肠道及肿瘤微环境中T细胞的耗竭演变规律，共鉴定出6种CD4⁺T细胞亚型、8种CD8⁺T细胞亚型及γδT细胞亚群。
结果显示，CD160仅特异性表达于T细胞前体耗竭阶段，是界定具有免疫再激活潜能T细胞的新型标志物。CD160⁺T细胞维持高细胞毒性、低耗竭的功能特征，而CD160⁻T细胞多处于不可逆的功能衰竭状态。细胞分布特征分析表明，回肠组织中IEL-T细胞经典活化标志物高表达、活化相关基因显著上调；而CRC肿瘤组织中CD4⁺、CD8⁺T细胞活化基因表达下调，耗竭相关基因异常激活。Treg、TFH细胞主要富集于肿瘤组织与引流淋巴结，回肠及结肠正常组织以初始T细胞、中心记忆T细胞、效应记忆T细胞为主，CD4⁺细胞毒性T细胞则主要分布于外周血与回肠组织。
新抗原反应性分析证实，CRC肿瘤浸润的Treg、TFH及TCRαβ⁺IEL-T细胞呈现肿瘤特异性活化状态，而健康人群回肠T细胞的新抗原反应性最低。其中，CRC组织中的TCRαβ⁺IEL-T细胞兼具最高的活化与耗竭特征，且富集大量预后相关基因及免疫检查点阻断治疗应答相关基因。耗竭亚型分层分析显示，正常回肠、结肠组织的IEL-T细胞以良性前体耗竭表型为主，而CRC肿瘤组织中IEL-T细胞多进展为恶性终末耗竭表型；γδT细胞的细胞毒性则呈现“回肠最高、肿瘤最低”的分布特征，进一步印证了肠道不同节段的免疫功能差异。
3.3 CD160调控CD8⁺T细胞耗竭状态的动态转变
为明确CD160与T细胞耗竭转化的关联，该研究针对TCRαβ⁺IEL-T细胞开展伪时间轨迹分析。结果显示，T细胞耗竭轨迹起源于正常回肠、结肠组织，后续分化出两条肿瘤特异性富集分支。沿伪时间推演进程，T细胞终末耗竭信号持续增强，前体耗竭信号逐步衰减，完美复刻了前体耗竭T细胞向终末耗竭T细胞的恶性转化过程。经典耗竭标志物分析显示，终末耗竭标志基因EOMES、TOX的表达量随伪时间进展持续上调，而前体耗竭标志基因IL7R、REL的表达显著下调。
CD160在回肠、结肠、肿瘤组织中呈动态差异性表达，其表达水平与IEL-T细胞耗竭状态转化高度耦合。多重免疫荧光染色与流式细胞术检测结果一致证实，CD160⁺CD8⁺T细胞浸润比例为回肠最高、CRC肿瘤组织最低，小鼠模型实验也验证了该组织分布规律。相关性分析表明，CD160表达水平与T细胞前体耗竭表型呈显著正相关，与终末耗竭表型呈显著负相关，明确其为前体耗竭T细胞的特异性标志分子。
T细胞克隆谱系分析显示，CRC肿瘤组织中的TCRαβ⁺IEL-T细胞克隆大多起源于肠道正常组织的CD160⁺T细胞克隆；肿瘤特异性T细胞克隆中终末耗竭细胞比例显著升高、前体耗竭细胞比例降低。正常组织中CD160⁺CD8⁺T细胞具备更强的克隆扩增能力，而肿瘤微环境中该优势显著减弱。跨组织转录特征分析证实，CD160⁺CD8⁺T细胞在不同组织中均维持稳定的前体耗竭表型与一致的转录特征，CD160⁻CD8⁺T细胞则更易进展为终末耗竭状态。MC38小鼠模型实验进一步验证，CD160⁺CD8⁺T细胞的前体耗竭比例显著高于CD160⁻细胞。上述结果表明，CD160可稳定维持CD8⁺T细胞的前体耗竭特性，有效抑制T细胞耗竭进程。
3.4 CD160⁺CD8⁺T细胞兼具高细胞毒性与抗耗竭能力并抑制结直肠癌进展
该研究结合人类临床样本与多种小鼠CRC模型，系统验证了CD160⁺CD8⁺T细胞的抗肿瘤功能。体外功能实验结果显示，相较于CD160⁻CD8⁺T细胞，CD160⁺CD8⁺T细胞可分泌更高水平的颗粒酶B与干扰素γ，具备更强的肿瘤细胞杀伤活性；在长期持续性抗原刺激的体外模型中，CD160⁺CD8⁺T细胞的抗耗竭能力显著优于CD160⁻细胞，终末耗竭表型发生率显著降低。
体外刺激实验证实，经CD3/CD28共刺激活化后，CD160⁺CD8⁺T细胞中GzmB阳性功能性细胞比例显著升高，细胞毒性功能显著增强；慢性抗原刺激模型中，CD160⁺CD8⁺T细胞可有效抵抗终末耗竭转化，维持稳定的免疫功能。将小鼠MC38肿瘤模型中分离扩增的CD160⁺CD8⁺T细胞与自体肿瘤细胞共培养后，可显著诱导肿瘤细胞凋亡，杀伤效果显著优于CD160⁻细胞。
体内过继转移实验显示，CD160⁺CD8⁺T细胞可高效浸润至肿瘤组织，并快速获得肿瘤抗原特异性杀伤能力。在AOM/DSS炎症诱导型CRC小鼠模型中，过继转移CD160⁺CD8⁺T细胞可显著减少肿瘤数量、缩小肿瘤体积，而CD160⁻CD8⁺T细胞无明显抗肿瘤效应。无论在肿瘤早期或晚期干预，回输CD160⁺CD8⁺T细胞均可有效提升肿瘤浸润CD8⁺T细胞的GzmB表达水平，持续抑制肿瘤增殖进展。上述结果证实，CD160⁺CD8⁺T细胞兼具高细胞毒性、抗耗竭、强效抗肿瘤的三重特征，且其抗肿瘤效应依赖于肿瘤免疫原性。
3.5 CD160缺失诱导CD8⁺T细胞终末耗竭、削弱抗肿瘤免疫功能
为明确CD160的功能必要性，该研究构建Cd160全基因敲除（Cd160⁻/⁻）小鼠，通过AOM/DSS炎症诱导模型与MC38皮下荷瘤模型，探究CD160缺失对CRC进展及T细胞功能的影响。结果显示，相较于野生型小鼠，Cd160⁻/⁻小鼠肿瘤发生数量更多、肿瘤体积更大，肿瘤进展速度显著加快。
Rescue实验结果表明，向Cd160⁻/⁻小鼠体内过继转移CD160⁺CD8⁺T细胞，可显著逆转肿瘤快速进展的表型，有效抑制肿瘤生长；而转移CD160⁻CD8⁺T细胞无法发挥抗肿瘤作用。免疫微环境分析显示，Cd160⁻/⁻小鼠肿瘤组织中浸润的GzmB⁺功能性CD8⁺T细胞数量显著减少，而过继回输CD160⁺CD8⁺T细胞可有效恢复功能性T细胞比例，该结果经免疫组化实验进一步验证。
T细胞耗竭表型分型结果显示，Cd160⁻/⁻小鼠肿瘤浸润CD8⁺T细胞中，TCF1⁺PD-1⁺前体耗竭细胞比例显著下降，TCF1⁻PD-1⁺终末耗竭细胞比例异常升高，T细胞耗竭进程显著加速。过继转移CD160⁺CD8⁺T细胞可有效恢复前体耗竭T细胞储备、抑制终末耗竭转化，而CD160⁻CD8⁺T细胞无此修复功能。综上，CD160缺失会直接损伤CD8⁺T细胞的细胞毒性功能，加速T细胞终末耗竭，促进CRC恶性进展，同时减少对抗PD-1治疗敏感的前体耗竭T细胞亚群，揭示了CD160在提升CRC免疫治疗疗效中的潜在核心价值。
3.6 CD160⁺CD8⁺T细胞增敏抗PD-1治疗、克服MSI-H CRC免疫耐药
该研究进一步验证了CD160⁺CD8⁺T细胞对CRC抗PD-1免疫治疗的增敏作用。MC38荷瘤小鼠模型干预结果显示，CD160⁺CD8⁺T细胞联合抗PD-1抗体治疗可几乎完全清除肿瘤病灶，疗效显著优于单独抗PD-1治疗、单独细胞回输治疗；而CD160⁻CD8⁺T细胞无法增强抗PD-1治疗效果。机制层面，CD160⁺CD8⁺T细胞可显著提升肿瘤微环境中GzmB⁺功能性CD8⁺T细胞比例，联合治疗组的免疫活化效果最为显著。同时，CD160⁺CD8⁺T细胞可特异性上调TCF1⁺PD-1⁺前体耗竭T细胞比例，不影响终末耗竭T细胞水平，有效储备具有免疫再激活潜能的T细胞，该现象经多重免疫组化实验进一步证实。
在AOM/DSS诱导的耐药型CRC模型中，单独抗PD-1抗体治疗无明显抑瘤效果，而联合CD160⁺CD8⁺T细胞过继转移可显著降低肿瘤负荷、小幅延长小鼠生存期。临床样本验证方面，纳入13例接受抗PD-1免疫治疗的MSI-H型CRC患者进行回顾性分析，结果显示免疫治疗敏感组患者的肿瘤浸润CD8⁺T细胞中CD160表达水平显著高于耐药组；且CD160高表达与患者预后改善显著相关，该预后预测价值独立于CD8⁺T细胞浸润密度。
针对抗PD-1耐药的MC38模型，过继回输CD160⁺CD8⁺T细胞可有效恢复肿瘤对抗PD-1治疗的敏感性，实现肿瘤近乎完全清除；同时显著提升肿瘤微环境中功能性GzmB⁺CD8⁺T细胞与前体耗竭T细胞比例，而CD160⁻CD8⁺T细胞无逆转耐药的作用。上述体内外实验与临床样本数据共同证实，CD160⁺CD8⁺T细胞可有效提升MSI-H CRC的免疫治疗敏感性，是逆转抗PD-1耐药的关键细胞亚群。
3.7 CD160通过AKT–NF-κB通路激活并维持CD8⁺T细胞抗肿瘤功能
为阐明CD160调控CD8⁺T细胞功能的分子机制，该研究对小鼠脾脏分选的CD160⁺、CD160⁻CD8⁺T细胞进行转录组差异分析。结果显示，CD160⁺CD8⁺T细胞中Fcer1g、Tnfrsf9（4-1BB）基因显著上调，差异基因主要富集于T细胞活化、NF-κB信号通路及T细胞介导的细胞毒性通路。
基因功能验证实验表明，CD160过表达可显著诱导CD160⁻CD8⁺T细胞上调FcεR1γ与4-1BB表达；敲低Fcer1g或Tnfrsf9可显著降低CD160⁺CD8⁺T细胞的GzmB表达水平、削弱细胞毒性，而过表达上述两个基因可有效恢复CD160⁻CD8⁺T细胞的抗肿瘤功能。临床样本与动物模型检测结果一致显示，CRC患者及MC38荷瘤小鼠的肿瘤浸润CD160⁺CD8⁺T细胞中，FcεR1γ与4-1BB均维持高水平表达。
通路机制研究证实，CD160⁺CD8⁺T细胞可特异性激活经典NF-κB（p65）信号通路，促进p65蛋白核转位，进而启动下游Fcer1g、Tnfrsf9基因的转录激活；阻断NF-κB核转位可显著抑制上述基因的表达，逆转T细胞高活性表型。同时，CD160⁺CD8⁺T细胞中PI3K–AKT通路持续活化，p-AKT蛋白表达水平显著升高。
免疫共沉淀与邻近标记实验证实，CD160可直接结合PI3K调节亚基p85α，弱结合p110δ亚基，与其他PI3K p110家族亚基无相互作用。分子动力学模拟分析进一步验证，CD160与p85α的结合模式稳定性最高。功能回补实验显示，敲低p85α可完全阻断CD160介导的AKT磷酸化及GzmB表达上调，而敲低p110δ无明显抑制效果。综上，CD160通过特异性结合PI3K p85α，激活AKT–NF-κB信号通路，上调FcεR1γ与4-1BB表达，最终维持CD8⁺T细胞的高细胞毒性与抗耗竭功能。
四、研究总结
该研究依托单细胞多组学技术，系统绘制了人类回肠、正常结肠及CRC肿瘤组织的免疫细胞全景图谱，阐明了肠道不同节段免疫微环境的功能差异，从免疫学角度解释了空肠与结肠癌变风险差异的核心机制。研究首次证实，回肠组织特异性富集的CD160⁺CD8⁺T细胞，具备强克隆扩增能力、抵抗终末耗竭、高细胞毒性的核心特征，是肠道天然抗肿瘤免疫屏障的关键细胞亚群；而CRC肿瘤微环境会诱导T细胞持续耗竭，破坏肠道免疫防御稳态。
伪时间轨迹与克隆谱系分析明确了CD160是CD8⁺T细胞前体耗竭状态的特异性标志物，可跨组织稳定维持T细胞的可逆性活化潜能，抑制T细胞向终末耗竭状态转化。多维度体内外功能实验证实，CD160⁺CD8⁺T细胞可强效抑制CRC肿瘤增殖，提升肿瘤微环境中功能性免疫细胞比例，显著增强MSI-H CRC对抗PD-1免疫治疗的敏感性，有效逆转临床常见的免疫耐药难题。
机制层面，该研究阐明了全新的CD160调控通路：CD160通过直接结合PI3K调节亚基p85α，激活下游AKT–NF-κB信号通路，上调FcεR1γ与4-1BB分子表达，进而持续维持CD8⁺T细胞的活化状态与肿瘤杀伤毒性。该研究完善了CRC肿瘤免疫微环境的调控网络，确立了CD160作为CRC免疫治疗新型靶点的科学价值，创新性提出CD160⁺CD8⁺T细胞过继转移的免疫治疗新策略，为破解MSI-H CRC抗PD-1耐药、提升临床免疫治疗疗效提供了坚实的理论基础与实验依据。
五、单细胞多组学服务哪里有？
沪公网安备31011502400759号
营业执照(三证合一)
