摘要

G蛋白偶联受体激酶（GRKs）可通过在七跨膜受体胞内区域形成特异性磷酸化“条形码”，介导差异化的细胞信号应答，是G蛋白偶联受体（GPCR）功能分化的核心调控方式。目前学界尚不明确阻遏蛋白（Arrestin）如何特异性识别不同GRK介导的磷酸化条形码，并引发不同下游功能。该研究以非典型趋化因子受体ACKR3为研究对象，利用新型探针Fab7结合冷冻电镜技术，解析了GRK2与GRK5磷酸化修饰下ACKR3与Arrestin2（ARR2）、Arrestin3（ARR3）的复合物结构。结果表明，GRK2与GRK5的磷酸化位点分布存在显著差异，分别介导ACKR3与Arrestin形成不稳定的“尾部模式”复合物及高稳定性的“受体邻近型”复合物。两种Arrestin亚型的finger loop均结合胶束表面，而非传统的受体内口袋结合模式。ARR3因缺乏膜锚定结构具备更强的构象动态性，而磷酸化条形码与受体跨膜区的空间距离，而非磷酸化序列本身，是决定复合物构象与稳定性的关键。该研究明确了GRK亚型、Arrestin亚型协同调控GPCR-Arrestin复合物构象与功能的分子机制，为解析ACKR3介导的趋化因子清除、信号调控差异提供了结构基础。

一、引言

G蛋白偶联受体激酶可在GPCR胞内尾部催化产生特异性磷酸化修饰，形成具有位点特异性的磷酸化“条形码”，该修饰模式被认为主导GPCR激活后的功能分化，调控受体脱敏、内吞及下游信号转导等多种细胞过程。不同GRK亚型介导的磷酸化修饰可诱导完全不同的细胞应答，例如GRK2与GRK6均可介导β2AR脱敏，但仅GRK6可激活ERK1/2信号通路，证实GRK磷酸化条形码的功能特异性。

Arrestin家族包含ARR2、ARR3两种核心亚型，二者在GPCR信号调控中发挥差异化功能，是解码磷酸化条形码、介导下游功能分化的关键分子。已有研究推测，不同GRK磷酸化条形码可驱动Arrestin产生不同构象，进而实现功能分化，但该假说的具体分子机制始终缺乏直接结构证据支撑。

ACKR3是一类非典型趋化因子受体，不激活经典G蛋白信号通路，主要依赖GRK介导的磷酸化修饰招募Arrestin，通过清除趋化因子CXCL12调控CXCR4信号强度，是研究GPCR磷酸化条形码调控机制的理想模型。该研究通过解析GRK2、GRK5磷酸化修饰的ACKR3与两种Arrestin亚型的复合物冷冻电镜结构，系统阐释磷酸化条形码调控Arrestin结合模式、复合物构象及动态特征的分子机制，为揭示GPCR信号偏倚调控的通用机制提供理论依据。

二、材料与方法

（一）实验材料与蛋白构建

该研究采用活化型CXCL12LRHQ激活ACKR3受体，构建预活化ARR2、ARR3突变体以稳定受体-蛋白复合物。通过噬菌体展示筛选得到特异性探针Fab7，专一识别活化态ARR2/ARR3。同时构建ACKR3+12G、ARR2-FL4A等突变载体，搭配人源GRK2、GRK5质粒，用于后续磷酸化修饰与机制验证实验。

（二）体外结合实验

以未磷酸化ACKR3为阴性对照，利用CXCL12LRHQ活化受体后，分别经GRK2、GRK5体外磷酸化。通过pull-down联合Western blot定量检测不同磷酸化修饰的ACKR3与ARR2*、ARR3*的结合差异，并设置CID24探针竞争实验，探究受体胞内口袋对Arrestin结合的调控作用。

（三）冷冻电镜结构解析

在LMNG/CHS胶束与POPC/POPS纳米盘体系中组装pACKR3-Arrestin-Fab7三元复合物，通过冷冻电镜解析四类核心复合物三维结构。结合结构比对、RMSD计算、主成分分析及荧光探针检测，系统对比不同复合物的构象差异、动态特征与蛋白-脂质相互作用差异。

（四）细胞水平功能验证

在HEK293T细胞中共转染相关质粒，利用BRET实验检测CXCL12刺激后Arrestin的细胞招募动力学，分别检测2 min早期快速招募、20 min稳态结合两个时间节点，验证finger loop结构对Arrestin动态结合的调控功能。

三、实验结果

（一）GRK磷酸化是ACKR3招募Arrestin的必要条件

Pull-down实验结果显示，未经过GRK磷酸化修饰的ACKR3无法结合ARR2与ARR3，证实ACKR3对Arrestin的招募完全依赖GRK介导的磷酸化修饰。GRK2与GRK5对ACKR3的磷酸化位点存在明显偏好：GRK2主要磷酸化远离跨膜区的丝氨酸/苏氨酸位点，GRK5优先修饰跨膜近端位点，部分位点与GRK2重叠。

定量结合实验表明，GRK5磷酸化的ACKR3与Arrestin的结合亲和力显著高于GRK2，对ARR2的结合量提升约30%，对ARR3的结合量提升约40%，证明不同GRK亚型介导的磷酸化条形码可直接调控ACKR3与Arrestin的结合效率。

图1.Arrestin与ACKR3的结合以及Fab7的识别依赖于GRK2/5磷酸化

（二）Fab7探针可稳定活化Arrestin并实现复合物结构解析

针对传统探针无法捕获pACKR3-Arrestin复合物的问题，该研究筛选得到新型探针Fab7。该探针可特异性结合活化态的ARR2与ARR3，不与受体肽段发生相互作用，能够稳定Arrestin的活化构象，显著提升复合物均一性与结合能力。

基于Fab7探针，该研究成功解析四种核心复合物冷冻电镜结构。结果显示，GRK5磷酸化形成的复合物结构有序性更高、稳定性更强；ARR2相关复合物的整体分辨率显著高于ARR3，提示ARR3复合物的构象动态性更强。同时在纳米盘体系中捕获到pACKR3GRK2-Arr2的经典“尾部结合模式”，仅受体C末端磷酸肽参与结合，无跨膜区相互作用。

图2.Fab7作为一种新的Arrestin构象探针，使得pACKR3–Arr2和pACKR3–Arr3复合物结构解析成为可能

（三）ACKR3-ARR2复合物存在独特的结构结合特征

pACKR3GRK5-ARR2复合物整体分辨率达3.4 Å，跨膜螺旋结构完整，呈现接近激活态的受体构象。结构分析显示，ACKR3的TM7至H8连接段（Ser316–Tyr322）可与ARR2的N端及C环形成疏水互作界面，同时TM1螺旋发生约7°弯折以规避空间结构冲突。定点突变实验证实，ACKR3的Phe317、Ile318位点及ARR2对应互作残基是维持复合物稳定的核心位点，突变后二者结合能力显著下降。

该研究发现全新结合模式：所有复合物中ARR2的finger loop均结合胶束表面疏水区域，而非嵌入受体胞内口袋，与经典GPCR-Arrestin结合模式存在本质差异。荧光探针实验证实，finger loop、C环等结构域与胶束的相互作用在GRK5磷酸化体系中更强，证明磷酸化条形码可调控蛋白-脂质相互作用及复合物构象。

图3.pACKR3GRK5–Arr2*复合物展现出独特的“TM7–H8连接子模式”及新的finger loop–胶束相互作用

（四）Finger loop结构介导Arrestin早期快速招募

受体胞内口袋特异性探针CID24可完全占据ACKR3胞内裂口，但仅微弱抑制ARR2与受体的结合（抑制率10%~20%），提示ARR2结合ACKR3不依赖受体胞内口袋，CID24仅通过变构效应调控结合过程。

Finger loop突变体FL4A功能实验显示，该突变体结合pACKR3GRK5的能力与野生型无差异，但结合pACKR3GRK2的效率显著下降30%，说明finger loop结构对GRK2介导的远端磷酸化条形码高度依赖，对GRK5近端条形码无明显作用。细胞BRET动力学实验证实，finger loop主要调控Arrestin的早期招募：刺激2 min时，突变体招募效率下降50%，而20 min稳态结合阶段与野生型无差异，证实其仅负责快速初始结合，不影响后期复合物稳定性。

图4.  Arr2 finger loop在结合ACKR3过程中的作用受ACKR3磷酸化条形码影响

（五）磷酸化条形码与跨膜区距离决定复合物构象稳定性

结构比对发现，GRK2与GRK5介导的磷酸化肽段序列不同，分别为351-EpTEYpSAL-357与337-KpTGLpTKL-343，但二者均可与ARR2形成高度相似的电荷与疏水相互作用，推导得到ACKR3磷酸化条形码保守序列为X(pT)XX(pS/T)Xϕ。两种模式下ARR2的整体构象几乎一致（RMSD=0.67 Å），证明磷酸肽序列本身不决定复合物构象差异。

空间结构分析显示，GRK5磷酸化条形码相较于GRK2更靠近受体跨膜区，间距相差14个氨基酸残基，可促使ARR2贴近受体跨膜结构，强化TM7–H8连接区与胶束的相互作用。通过ACKR3+12G突变人为拉长GRK5条形码与跨膜区的距离后，复合物结构异质性显著提升，TM7–H8稳定界面消失，结构特征趋近于GRK2介导的尾部模式复合物。该结果证实，磷酸化条形码与跨膜区的空间距离是调控复合物构象与稳定性的核心因素。

图5.GRK介导的磷酸化条形码决定Arrestin与ACKR3的不同结合模式

（六）ARR2与ARR3的膜锚定差异导致功能与构象分化

在相同磷酸化修饰条件下，ARR3复合物结构分辨率更低、构象更动态。结构差异分析表明，ARR2具有特异性C-edge膜锚定结构，可稳定结合胶束，而ARR3天然缺失该结构，仅依靠finger loop与胶束产生微弱相互作用。将ARR2的338-loop序列导入ARR3后，可有效增强ARR3的膜锚定能力，提升复合物结构完整性。

尽管ARR2与ARR3的磷酸肽结合关键残基高度保守，对两类磷酸化条形码的结合模式基本一致，但主成分分析显示，二者的分子内扭转角度存在固有差异，激活构象截然不同。在GRK2磷酸化体系中，ARR3与胶束的相互作用最弱，构象动态性最显著，最终导致两种Arrestin亚型的下游功能分化。

图6. Arr3与ACKR3的结合方式区别于Arr2，但对不同GRK亚型的条形码有相似响应

四、结论

该研究以非典型趋化因子受体ACKR3为研究模型，利用新型构象探针Fab7结合冷冻电镜技术，揭示了磷酸化条形码调控Arrestin结合与复合物构象的核心机制。GRK2与GRK5介导的差异化磷酸化修饰，通过改变条形码与受体跨膜区的空间距离，分别形成不稳定的尾部模式复合物与高稳定性的受体邻近型复合物。磷酸肽保守序列仅维持基础结合能力，不主导构象分化。Arrestin亚型的膜锚定结构差异决定了复合物的动态特征，ARR2的C-edge结构显著提升复合物稳定性，而ARR3构象更具动态性。同时Arrestin finger loop特异性调控早期受体招募过程，依赖GRK2介导的远端磷酸化条形码。

该研究明确了GRK亚型、Arrestin亚型、膜微环境三重因素协同调控GPCR-Arrestin复合物结构与功能的分子机制，为解析磷酸化条形码假说提供了关键结构证据，也为趋化因子信号调控、GPCR靶向药物研发提供了重要的理论支撑。

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