简述
Bulk转录组测序（Bulk RNA-seq）作为分析组织样本整体基因表达谱的核心技术，在揭示疾病分子机制、识别预后标志物及解析肿瘤微环境细胞组成方面仍具有不可替代的价值。近年研究表明，将常规差异表达分析与免疫细胞浸润反卷积算法相结合，可系统性解析肿瘤影像学与病理学进展的异质性，为临床预后分层提供分子依据。本文以肺腺癌GGO进展研究为范例，系统阐述Bulk转录组测序的技术原理、分析策略及其在肿瘤微环境研究中的拓展应用，以期为相关领域研究者提供深入的技术性参考框架。
Bulk转录组测序（Bulk RNA-seq）作为分析组织样本整体基因表达谱的核心技术，在揭示疾病分子机制、识别预后标志物及解析肿瘤微环境细胞组成方面仍具有不可替代的价值。近年研究表明，将常规差异表达分析与免疫细胞浸润反卷积算法相结合，可系统性解析肿瘤影像学与病理学进展的异质性，为临床预后分层提供分子依据。本文以肺腺癌GGO进展研究为范例，系统阐述Bulk转录组测序的技术原理、分析策略及其在肿瘤微环境研究中的拓展应用，以期为相关领域研究者提供深入的技术性参考框架。
一、Bulk转录组测序的技术原理与核心方法
Bulk转录组测序是对样本中所有RNA分子进行高通量测序，以全面捕获编码RNA及非编码RNA的表达量、基因融合、可变剪接及突变信息的技术。与单细胞测序不同，Bulk RNA-seq反映的是细胞群体的平均表达水平，适用于分析组织或细胞群体层面的转录调控模式。
（一）标准化实验流程
Bulk RNA-seq实验流程包括RNA提取、文库构建与高通量测序三个阶段。提取的总RNA需去除基因组DNA及其他杂质，通过Poly(A)选择或rRNA去除进行目标RNA富集，随后逆转录为cDNA，经片段化、接头连接与扩增构建测序文库。数据分析核心环节包括：原始数据质量控制（去除低质量序列与接头）；与参考基因组比对（如STAR、Kallisto等比对工具）；定量分析（计算FPKM、TPM或Counts值）；差异表达分析（如DESeq2、edgeR）；以及功能富集分析（GO和KEGG通路）。
Bulk RNA-seq实验流程包括RNA提取、文库构建与高通量测序三个阶段。提取的总RNA需去除基因组DNA及其他杂质，通过Poly(A)选择或rRNA去除进行目标RNA富集，随后逆转录为cDNA，经片段化、接头连接与扩增构建测序文库。数据分析核心环节包括：原始数据质量控制（去除低质量序列与接头）；与参考基因组比对（如STAR、Kallisto等比对工具）；定量分析（计算FPKM、TPM或Counts值）；差异表达分析（如DESeq2、edgeR）；以及功能富集分析（GO和KEGG通路）。
（二）成本与通量的优化进展
近年发展的BOLT-seq等新型3'末端mRNA测序方法，利用细胞裂解液直接进行逆转录，省去中间产物纯化步骤，可在单管内完成文库构建，每样本成本低于1.4美元，大幅提升了Bulk RNA-seq在药物筛选等大规模场景中的可及性。
近年发展的BOLT-seq等新型3'末端mRNA测序方法，利用细胞裂解液直接进行逆转录，省去中间产物纯化步骤，可在单管内完成文库构建，每样本成本低于1.4美元，大幅提升了Bulk RNA-seq在药物筛选等大规模场景中的可及性。
二、基于Bulk转录组的肿瘤微环境解析策略
肿瘤微环境（TME）是包含多种免疫细胞、基质细胞及肿瘤细胞的复杂生态系统，其细胞组成与相互作用直接影响肿瘤进展与治疗响应。Bulk转录组数据通过反卷积算法推断各类细胞相对比例，是解析TME浸润特征的主要手段之一。
（一）从差异表达到细胞组成推断
传统Bulk分析流程以差异表达基因识别和通路富集为基础，以揭示不同病理状态下的核心生物学过程。在肺腺癌研究中，研究者通过WGCNA共表达模块分析，识别出与GGO成分及实体进展相关的三个核心基因模块（M1、M2、M3），发现M3模块（富含增殖相关基因）在GGO样LUAD中表达下调，提示其与惰性表型及良好预后相关。
传统Bulk分析流程以差异表达基因识别和通路富集为基础，以揭示不同病理状态下的核心生物学过程。在肺腺癌研究中，研究者通过WGCNA共表达模块分析，识别出与GGO成分及实体进展相关的三个核心基因模块（M1、M2、M3），发现M3模块（富含增殖相关基因）在GGO样LUAD中表达下调，提示其与惰性表型及良好预后相关。
（二）反卷积算法与免疫细胞定量
利用基因表达数据进行免疫细胞比例反卷积（如CIBERSORT、xCell等），可从Bulk数据中推断Treg、CD8+ T细胞等免疫亚群的浸润丰度。在一项肺腺癌影像-病理研究中，反卷积分析显示从AIS&MIA到LUAD，Treg比例显著上升，而CD8+ T细胞的杀伤功能（以穿孔素分泌为代表）受到抑制，提示Treg上调可能通过削弱CD8+ T细胞的功能而非直接减少其数量来驱动免疫逃逸。流式细胞术进一步验证了这一趋势。值得注意的是，近年来开发的CrosstalkIn框架通过整合GO功能相似性与蛋白质互作网络，构建患者特异性细胞-细胞网络，可更准确地从Bulk数据中推断细胞浸润分数，在多个癌种中实现了生存风险分层与免疫治疗响应预测。
利用基因表达数据进行免疫细胞比例反卷积（如CIBERSORT、xCell等），可从Bulk数据中推断Treg、CD8+ T细胞等免疫亚群的浸润丰度。在一项肺腺癌影像-病理研究中，反卷积分析显示从AIS&MIA到LUAD，Treg比例显著上升，而CD8+ T细胞的杀伤功能（以穿孔素分泌为代表）受到抑制，提示Treg上调可能通过削弱CD8+ T细胞的功能而非直接减少其数量来驱动免疫逃逸。流式细胞术进一步验证了这一趋势。值得注意的是，近年来开发的CrosstalkIn框架通过整合GO功能相似性与蛋白质互作网络，构建患者特异性细胞-细胞网络，可更准确地从Bulk数据中推断细胞浸润分数，在多个癌种中实现了生存风险分层与免疫治疗响应预测。
（三）Bulk与单细胞数据的整合价值
单细胞测序（scRNA-seq）虽可解析细胞异质性，但受限于样本量和成本，难以大规模应用于临床队列。将scRNA-seq识别的细胞类型特征基因作为参考，在Bulk数据中进行反卷积，可实现"单细胞精度特征、Bulk规模验证"的策略。近期基于图深度学习的整合方法（如scBGDL）构建样本特异性基因图，通过图注意力网络与Transformer模块捕捉高阶生物学依赖，在16种癌症类型中显著优于现有预后预测方法，为Bulk与单细胞数据的协同分析提供了新框架。
单细胞测序（scRNA-seq）虽可解析细胞异质性，但受限于样本量和成本，难以大规模应用于临床队列。将scRNA-seq识别的细胞类型特征基因作为参考，在Bulk数据中进行反卷积，可实现"单细胞精度特征、Bulk规模验证"的策略。近期基于图深度学习的整合方法（如scBGDL）构建样本特异性基因图，通过图注意力网络与Transformer模块捕捉高阶生物学依赖，在16种癌症类型中显著优于现有预后预测方法，为Bulk与单细胞数据的协同分析提供了新框架。
三、典型案例解析：肺腺癌GGO影像-病理分子机制研究
（一）研究背景与设计思路
随着早期肺癌筛查的普及，磨玻璃样结节（GGO）的检出率显著提高。GGO分为纯GGO（pGGO，无实变）、混合GGO（mGGO）和实性结节。pGGO多见于肺腺癌的前驱/微浸润阶段，此类GGO样肺癌生长缓慢、预后良好，被视为"惰性"肿瘤。
随着早期肺癌筛查的普及，磨玻璃样结节（GGO）的检出率显著提高。GGO分为纯GGO（pGGO，无实变）、混合GGO（mGGO）和实性结节。pGGO多见于肺腺癌的前驱/微浸润阶段，此类GGO样肺癌生长缓慢、预后良好，被视为"惰性"肿瘤。
研究者从多个公共数据库（包括EGAS00001004006、TCGA及GSE系列数据集）收集了大量肺腺癌Bulk转录组数据，对AIS&MIA与LUAD的GGO亚型进行了基因组和转录组比较，旨在揭示驱动放射学进展（GGO→实性）与病理进展（AIS&MIA→LUAD）的分子事件差异。
（二）主要发现与证据链
1. 基因组事件的差异化驱动
LUAD实性结节的TMB显著高于GGO样LUAD，且TP53突变频率在实性结节中高达53%，而在GGO样LUAD中仅约13%。APOBEC相关突变富集评分及吸烟相关的SBS4信号同样在实性结节中明显增高。EGFR突变频率虽在LUAD中高于AIS&MIA，但与GGO成分的关联弱于TP53。这些结果提示病理进展与GGO成分变化由不同基因组事件共同主导。
LUAD实性结节的TMB显著高于GGO样LUAD，且TP53突变频率在实性结节中高达53%，而在GGO样LUAD中仅约13%。APOBEC相关突变富集评分及吸烟相关的SBS4信号同样在实性结节中明显增高。EGFR突变频率虽在LUAD中高于AIS&MIA，但与GGO成分的关联弱于TP53。这些结果提示病理进展与GGO成分变化由不同基因组事件共同主导。
2. 增殖模块的低表达与惰性表型
WGCNA共表达分析显示，M3模块基因（富含细胞增殖相关功能）在GGO样LUAD中显著下调，且其中多数基因与总生存期及无复发生存期强相关。该模块在实体结节中上调，与Ki67免疫组化阳性率升高一致，解释了GGO样结节生长缓慢的分子基础。
WGCNA共表达分析显示，M3模块基因（富含细胞增殖相关功能）在GGO样LUAD中显著下调，且其中多数基因与总生存期及无复发生存期强相关。该模块在实体结节中上调，与Ki67免疫组化阳性率升高一致，解释了GGO样结节生长缓慢的分子基础。
3. 微环境免疫格局的动态变化
从AIS&MIA到LUAD，Treg比例稳步上升，在实体结节中达到最高；CD8+ T细胞数量呈下降趋势但无统计学意义，但其分泌穿孔素的能力在实体结节中明显被抑制。流式细胞术验证了上述结果，提示免疫逃逸的主要机制可能为Treg上调削弱CD8+ T细胞的杀伤功能，而非直接减少其数量。
从AIS&MIA到LUAD，Treg比例稳步上升，在实体结节中达到最高；CD8+ T细胞数量呈下降趋势但无统计学意义，但其分泌穿孔素的能力在实体结节中明显被抑制。流式细胞术验证了上述结果，提示免疫逃逸的主要机制可能为Treg上调削弱CD8+ T细胞的杀伤功能，而非直接减少其数量。
（三）预后标志物的构建与验证
基于GGO与实体瘤差异表达基因，筛选出24个GGO/鳞屑状显性特异性基因和21个实体瘤显性特异性基因，构建了名为G2S的量化指标。在独立验证集中，G2S评分能够有效区分GGO样组与实体瘤样组，且GGO样组的总生存期和无复发生存期均显著优于实体瘤样组，证实了基于Bulk转录组构建的预后特征的临床实用性。
基于GGO与实体瘤差异表达基因，筛选出24个GGO/鳞屑状显性特异性基因和21个实体瘤显性特异性基因，构建了名为G2S的量化指标。在独立验证集中，G2S评分能够有效区分GGO样组与实体瘤样组，且GGO样组的总生存期和无复发生存期均显著优于实体瘤样组，证实了基于Bulk转录组构建的预后特征的临床实用性。
四、Bulk转录组测序检测服务哪里有？
乐备实可承接Bulk转录组测序及配套分析服务，依托成熟的RNA提取、文库构建与高通量测序平台，结合差异表达分析、功能富集及免疫浸润反卷积等标准生物信息学流程，可开展肿瘤微环境细胞组成解析、预后标志物筛选及药物响应相关转录特征发现等研究工作，为肿瘤机制研究与临床转化提供系统性的数据基础。
| 货号 | 产品名称 | 链指标 |
|---|---|---|
| LXLBH10-1 | 人炎症-10因子检测服务 | IL-1 β/IL-1F2，IL-2，IL-4，IL-6 ,IL-8/CXCL8，IL-10，IL-12 p70，IL-13，TNF-α，IFN-γ |
| LXLBH27-1 | 人细胞因子-27因子检测服务 | G-CSF,GM-CSF,IFN-γ,IL-10,IL-12(p70),IL-13,IL-17A,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8/CXCL8,MCP-1/CCL2,MIP-1β,TNF-α,IL-1Rα,IL-9,IL-15,FGF-basic,Eotaxin/CCL11,IP-10/CXCL10,MIP-1α/CCL3,PDGF-BB,RANTES,VEGF-A |
| LXLTM36-1 | 小鼠细胞因子/趋化因子-36因子检测服务 | GM-CSF,IFN gamma,IL-1 beta,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-12p70,IL-13,IL-18,TNF alpha,IL-9,IL-10,IL-17A (CTLA-8),IL-22,IL-23,IL-27,G-CSF (CSF-3),IFN alpha,IL-3,IL-15/IL-15R,IL-28,IL-31,IL-1 alpha,LIF,ENA-78 (CXCL5),M-CSF,Eotaxin (CCL11),GRO alpha (CXCL1),IP-10 (CXCL10),MCP-1 (CCL2),MCP-3 (CCL7),MIP-1 alpha (CCL3),MIP-1 beta (CCL4),MIP-2,RANTES (CCL5) |
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