Single-cell transcriptome analysis revealed a suppressive tumor immune microenvironment in EGFR mutant lung adenocarcinoma

既往研究发现，EGFR突变型肺腺癌(EGFR-LUAD)的PDL1表达和肿瘤突变负荷(TMB)都较低，免疫治疗疗效不佳. 而针对该疾病的免疫微环境(TME)尚不清楚，这都为GFR-LUAD的治疗增加了难度。

一篇广东省人民医院癌研究所周清教授(通讯作者)和杨蓄博(第-一作者)在Jual forImmunoTherapyof Cancei 杂志(IF=13.751)上发表的文章，题目为“Single-cell transcriptome analvsis revealed a suppressive tumor immune microenv ronment in EGFR mutant lung adenocarcinoma”。该文章基于BD Rhapsody单细胞分析系统，从细胞成分和功能的角度来揭示 EGFR突变型肺腺癌的特异性肿瘤微环境(TME)，为该疾病的免疫治疗策路提供了新的思路。

BDRhapsody单细胞分析系统

01   8名患者的9个LUAD肿瘤样本

EGFR突变(EFGR+):EGFR未突变(EFGR-)=5:4

其中EGFR-样本共获得18704个细胞，EGFR+获得了22095个细胞

02   公共数据库多原发性肺腺癌新辅助免疫治疗后样本(n=3)数据的联合分析

细胞聚类分析，差异基因表达分析，拟时序分析，细胞通讯分析，GOPathway分析，多重荧光免疫组化(mHC)等。

针对上皮细胞，采用sub-Cluster分析将9067个上皮细胞分为13个亚群，进一步采用inferCNV分析将其分为恶性上皮和 非恶性上皮两类，而差异基因表达分析发现，CCL18，CXCL和CXCL3在EGFR+组的恶性上皮细胞中表达水平更高，可能参 与巨噬细胞分化和招募Treg细胞;L-7和IL-8等基因在EGFR-组的表达相对更高，说明相较于EGFR+组，EGFR-的恶性上皮 可能更容易促进CD8+T细胞增殖。

针对数据的联合分析发现，EGFR+组的上皮细胞与免疫治疗无效样本的上皮特征相似，而EGFR-组与治疗有效样本的上 皮特征相似，即EGFR+肺腺癌可能对免疫治疗的反应较差。进一步的上皮细胞拟时序分析表明，EGFR的突变导致了正常上 皮细胞分化差异，而beam分析表明，EGFR+组的恶性上皮具有更多与代谢途径相关的基因(如糖酵解、氨基酸代谢等),可 能抑制了CD8+T在内的T细胞和其他免疫细胞的功能。

对T细胞的细分发现，CD8+组织驻留记忆细胞(CD8+TRM)和CD8+增殖T细胞(D8+cyclingT)主要存在于EGFR-组 中，且检测到CXCL13基因(参与促进三级淋巴结构生成)的表达，而EGFR+组中基本没有表达，说明EGFR+组缺乏 CD8+TRM且无法分泌CXCL13促进三级淋巴结构的生成。此外，差异基因表达分析还发现多种免疫检查点(PDCD1、 TNFRSF9和ICOS等)在EGFR-组的表达，而EGFR+组中很少但高表达一些免疫抑制因子(CCL4、IL-1B等)，以上分析结果也 得到了mIHC的验证，说明EGFR突变肺腺癌更难形成对免疫治疗有利的免疫微环境。

此外，研究团队发现CCL2、CCL13、GDF15和CXCL17高表达于EGFR+组中，这些细胞因子多与抑制免疫的微环境相关。 相比之下，EGFR-组中的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)可能通过表达CXCL9来招募TRM细胞增强肿瘤浸润效果。进一步的细胞 通讯分析发现，巨噬细胞是整个细胞通讯网络的关键环节，其中CHIT1 TAM亚群可能在EGFR·组的肿瘤微环境中具有很强的 调节能力，以直接和间接地介导TRM的激活和驻留，而在EGFR+肺腺癌中缺失相关的TAM5。相似的，EGFR+组也缺失相关 CAF，无法诱导CD8+T细胞转化为CD8+TRM细胞，即EGFR突变肺腺癌因缺失TAM和CAF，导致无法招募、驻留和扩展 CD8+TRM细胞，进而无法形成三级淋巴结构。

最后，基于CD8+TRM的重要性，研究团队采用细胞通讯分析发现，CD8+TRM与成纤维细胞和CHIT1_TAM等细胞存在相 互作用，如成纤维细胞通过TGFB2-TGFBR2和 TGFBTGFBR3配受体的结合，促进了CD8+T转化为CD8+TRM细胞。此外与 EGFR野生型肺腺癌相比，EGFR突变型肿瘤的T细胞和其他细胞类型之间的多种免疫检查点相关互作通讯显著减少(如PD-1 和PD-L1)，而缺乏CD8+TRM很可能是导致其形成肿瘤免疫抑制型微环境的关键因素。

研究团队利用单细胞测序联合公共数据分析、多重荧光免疫组化验证等方法，探索了单细胞水平上EGFR突变肺腺癌的 免疫微环境景观:多种细胞成分可能通过影响CD8+TRM抑制了EGFR突变LUAD的特异性肿瘤微环境，即CD8+TRM的缺陷可 能是EGFR突变型LUAD抑制性TME的关键因素。这也为EGFR突变肺腺癌的联合免疫治疗提供了新的思路。