Adoptive immunotherapy with transient anti-CD4 treatment enhances anti-tumor response by increasing IL-18Rahi CD8+ T cells

单细胞RNA测序技术已经被广泛应用于细胞治疗和抗肿瘤等相关研究中，今天为大家分享一篇发表在NATURE COMMUNICATIONS ( IF : 13 )上题为Adoptive immunotherapy with transient ant-CD4 treatment enhances anti-tumor response byincreasingIL-18Ra"CD8Tcells的高分文章。

过继T细胞疗法(ACT)利用体外的肿瘤反应性T细胞(ex-T细胞)(例如，分选细胞TILs和基因工程T细胞)输注到患者体 内，直接攻击恶性细胞。这类疗法通常需要淋巴细胞耗尽处理以消除免疫抑制因素，使过继转移的肿瘤反应性T细胞有效植 由于抗CD4单克隆抗体会消耗CD4+免疫抑制细胞，因此抗CD4治疗和ACT在癌症治疗中具有协同潜力。

本文作者用肿瘤反应性CD8+T细胞输注治疗，设计了CTX^pre/ACT/CD4^post的鼠黑色素治疗方案(CTX^pre，环磷酷胺预处 理，CD4 ^post，抗CD4后调节)，对过程机制进行深入研究。

作者设计了CTX^pre、ex-T细胞和CD4^post的协同增加ACT疗效的治疗方案(Fig 1A)，相比于CTX/anti-CD4或CTX/ex-T组 联合治疗组CTX ^pre/CD4^post显著增加了肿瘤抑制和exT-celetransferred老的存活率(Fig 1C，n=10 mice/组)。而且在CTX^pre CD4 ^post治疗的小鼠组中出现了白风，这暗示CD8·T细胞诱导黑素细胞的破坏、CD8+T细胞反应增强(Fig 1B，n=10 mite/组), 表明联合治疗黑色素瘤具有很强的潜力。

上一步暗示CD8+T细胞活性与抗肿瘤反应密切相关，作者检测了CTX^pre和CTX^pre/CD4^post的小鼠中CD8+T细胞的增殖和持久性将体外注入的Thy1.1⁺Pmel-1细胞(用黑色家特异诱导的CD8+T细胞，ex-T细胞)和未受刺激CD45.1+CD8+T细胞(en-T细 胞)标记不同的荧光，转移到种个或不种瘤57BL/6小鼠(Fig.2A)。评估在有或没有黑色素瘤的情况下了细胞的增殖情况。

作者发现无论肿雁是否存在CTx^pre/CD4^post都增加Thy.1+和CD45.1+细胸的数量(fig 2B,n=4 mice/组) Thy1.1+Pmel-1 细胞大量扩增，大多数迅速分裂并分化为CD44 ⁺CD62L^-效应记忆表型，明ex-T细胞具有增殖优势。

作者用同时分泌多种效应细胞因子的细胞比例，评估enT细胞的效应功能，发现CTX^pre/CD4^post的多功能en-T细胞的比 显著高于CTX ^pre组。

作者检测了黑色素瘤刺激后en-T细胞的CD25表达和杀伤活性在CTX^pre/CD4^post组中en-T细胞中表达CD25的细胞比例 明显高于CTX ^pre组(Fig.3C,n=4 mce/组)，提示抗CD4治疗提高了CD8+T细胞的肿反应性，体外杀伤实验进一步证实 CTX ^pre/CD4^post网的en-T细胞对黑色素瘤的杀伤效率高于CTX^pre的en-T细胞(Fig 3D)。而CTX^pre/CD4^post增加了肿内ex-T和en-T细 胞的漫润(fig 3G,n=4 mice/组)。

这些结果表明，在ACT联会模型中，使用抗CD4治疗增加了效应功能。肿瘤反应性和内源性CD8+T细胞的瘤内浸润。

为了进一步确定方案中有助于抗肿反应的因素，作者用微阵列技术研究了en-T细跑(Fg.4A)在CTX^pre/CD4^post免疫调节环 境中的CD8+T细胞的基因表达谱，发现在CTX ^pre/CD4^post的en-T细胞的Ifng和Il18r1上调，它们骗码IL-18-L-18R信号转导的 键成分在1L-18Ra表达水平分组的三个群体中，CTX ^pre/CD4^post小鼠L18Ra^hien-T细胞显著富集(Fig 4,n=5 mice/组)。

利用BukRNA测序对I-18Ra^hien-T细胞进行基因分析，发现在微阵列检测的CTX^pre/CD4^post中上调的与细胞增值/分化相 关的基因在L18Ra ^hienT细胞中上调了3倍，作者还通过多维蛋白表达分析，将IL-18Ra^hien-T细胞表型特征定义为CD44⁺ CD62L ^- CD49d^- CXCR3⁺T-bet⁺ (Fig4G)。

作者分选出IL-18Ra⁺en-T细胞，转移到Rag1敲除的B16-F10小鼠体内(Fig.5B)发现结合抗MHCI抗体治疗利于肿瘤治疗 (Fig5C, n=5,mice/组)，这意味着是MHC和TCR的相互作用对肿瘤有抑制作用。作者还通过一系列分析验证了 CTX ^pre/CD4^post治疗能诱导一个持续产生L-18Ra^hiCD8+T细胞的环境，该细胞在应答TCR和IL-18信号通路中发挥强大的效应功 能。而且IL-18Ra ⁺CD8-T细胞需要CTX^pre、IL-2、CD4^pos、Treg等多种因素协同诱导。

为了更详细地了解不同方案之间的差异，作者对淋巴样细胞进行了单细胞转录组分析，比较了两者的细胞亚群丰度和差 基国麦达情况。在细胞亚群组成上CD4 ^post的添加特异性地影响CD4+T细胞，而在其他中未观察到显著变化(Fig.s9a)。

作者对en-T和ex-T细胎进行单细胞转录组测序分析，以确定CD8+T细胞在CTX^pre、IL-2、CD4^pos的基因表达与CTX组相 比，CTX ^pre、IL-2、CD4^pos组的en-T和exT( Fg.6D,n=4,mice cells pooled)细高表达Il18r1的亚群中细数量更多。和Bulk测序结果 一致，这些核也显示了在1L-18Ra ^hi富集的en-T细中高表达的几个基因的显著表达。高表达Il8r1的亚群也高表达Il7r，表明 Il17r信号可以影响!L-18Ra ^hi 细胞的产生(Fig.6F)。

为了证实这一点，在目前的CTX^pre/CD4^pos方案中入了IL-7-FC治疗发现IL-7信号放大显著增加了L-18Ra^hiT和ex-T (Fig 6H,n=5mice/组)的数量和比例。

用ACT治疗B16-F10黑色素的小鼠模型中，CTX^pre/CD4^pos通过加速ex-T和en-T的增殖和分化来提高抗肿瘤疗效，提 高了lL-18Ra ^hiCD8+T亚群的频率，麦现出TCR/IL-18信号依赖的抗肿瘤活性。单细胞转录组分析进一步确认了对CD4+ 细胞和L-18Ra ^hiCD8+T的影响，后续实验表明，IL-7信号的扩增对L-18Ra^hiex-T和en-T细胞的增加至关重要。

这项研究强调了CD4在ACT中的临床相关性，提供了关于黑素瘤抗CD4治疗的免疫学性质的见解。进一步研究其 他肿瘤模型并将其转化，将为制定安全有效的ACT策略提供更多指导依据。