Nasal ciliated cells are primary targets for SARS-CoV-2 replication in the early stage of COVID-19

大量研究已证明，在COVID-19早期，患者上呼吸道会受到损害，但在细胞水平上，SARS·CoV·2的趋向性(tropism)尚 未完全明确。跟大家分享一篇近期发表在JCI(IF=14.808)上揭示SARS-Co-2感染早期相关机制的文章"Nasal iliated cels5 are primary targets for SARS-Cov-2 replication in the early stage of COVID-19"。文章结合免疫荧光染色( Immunofluorescence staining，IFS)和单细胞RNA测序技术(sRNA·seq)，详细解析了SARS-CoV-2感染相关的宿主分子在不同类型鼻腔上皮细胞 中的蛋白表达定位和mRNA的表达特征，揭示了SARSCoV-2在人鼻呼吸上皮组织中的细胞趋向性。

单细胞平台: BD Rhapsody

应用项目: BDRhapsody单细胞全转录组分析技术(WTA)

注：SARS-CoV-2病毒通过其本身的刺突蛋与宿主细胞的血管紧张素转化酶(Angiotensin-conveting enzyme 2ACE2) 的胞外受体结合域的相互作用介导进入宿主细胞。随后，由跨膜丝氨酸蛋白酶2( Transmembrane serine protease2，TMPRSS2). FURIN和其他蛋白酶进行的蛋白水解过程触发了病毒和细胞膜的融合。

01   SARS-CoV-2感染相关的宿主分子的mRNA表达水平和蛋白表达水平不一致

通过6例正常鼻腔上皮组织的免疫荧光染色发现，涉及SARS-CoV-2感染相关的宿主分子高度存在于人鼻呼吸上皮纤毛细 胞( Cliated cels，Acetylated-atubulin/E-cadherin:)的质端，而不存在于杯状细胞 ( Goblet cells，MUC5AC/E-cadherin') 上。可以认为上呼吸道特别是鼻腔ACE2h/纤毛上皮细胞可能是初始SARS·COV·2感染的主要靶细胞。

对上述样本的1721个鼻腔上皮细胞进行sCRNA-seq，鉴定出了5个细胞亚群(图M)。发现只有极少数上皮细胞可检测 到ACE2、TMPRSS2和FURINmRNA(图N)。揭示了相关宿主分子mRNA与蛋白表达的差异性。

本部分研究，利用BDRhapsody 单细胞多组学技术平台，对COVID-19患者鼻腔上皮细胞进行了单细胞全转录组表达解析。

01   健康供体与COVID-19患者中鼻腔上皮细胞组成及SARS-CoV-2感染相关的宿主分子基因表达的比较

为了明确SARS-CoV-2在鼻上皮中的细胞趋向性，收集了4份来自COVID-19患者第一天的样本和2份来自健康捐赠者的样本，在去除非上皮细胞(包括免疫细胞)后对63593个上皮细胞进行了SRNASeq(图A)。UMAP分析鉴定出了13个不同的上皮细胞亚群(图B)。与健康对照组相比，COVID-19患者中，分化分泌细胞(Secretory cel-dif.、纤毛前体细胞 ( Cllated cels-dif.1和Ciated cels-dif2)、BEST4( bestrophin-4 )^hi纤毛细胞和FN-y应答纤毛细胞的比例显著加(图 C)。但是，ACE2 mRNA+细胞仍然极为罕见(图D)。并且所有COVID-19患者的鼻腔上皮细胞ACE2 mRNA表达水平都明显偏低（图E)。

02   SARS-CoV-2在多纤毛上皮细胞中高度复制

接着，作者研究了SARS-CoV-2感染细胞的细胞组成和转录谱(图A)，鉴定出了约38%的感染细胞聚集而成的 SARS-CoV-2 ^hi细胞亚群(图B)。该亚群高表达SARS-CoV-2核衣壳、膜、开放阅读框和非翻译区mRNA(图C和D)。在 SARS-CoV-2 ^hi亚群检测到的基因中，约75%是来自于SARS-COV-2的病毒基因，而大多数其他亚群中每个细胞的病毒基因不到 1%(图E和F)，表明SARS-CoV-2hi细胞亚群代表了SARS-CoV-2高度复制的主要靶细胞。

由于SARS-CoV-2”细胞产生SARS-CoV-2 mRNA的比率很高，利用sRNASeq数据很难确定SARS-CoV-2^hi亚群的具体细胞类 型。所以，在这里作者进行了轨迹分析，推测SARS-CoV-2细胞可能是纤毛细胞。

03   SARS-CoV-2核衣壳蛋白定位在COVID-19患者的多纤毛上皮细胞

为了确定SARS-CoV-2^hi亚群的特定细胞类型，作者对来自OVID-19患者鼻腔的涂片上皮细胞进行免疫荧光染色(图 A)。与轨迹分析结果相符，只在多纤毛细胞中检测到核衣壳蛋白(NP)信号(图B-D)。杯状细胞(图F和G)、 KRT7”分 泌分化细胞(图IL)或KRT5 ^hi基底细胞中都未检测到NP信号。

04   4COVID19患者鼻腔多纤毛上皮细胞快速被前体细胞替代

为了阐明感染早期上皮细胞的变化，作者还收集了住院治疗后第1、3和6天的鼻腔和口腔上皮细胞，并对它们进行了 ScRNA:Seq和细胞学分析。鼻多纤毛细胞的数量在第3天显著减少，但在第6天前体细胞的数量出现反弹(图B和C)，这表 明受损的纤毛上皮细胞被其前体细胞主动替代。分化·分泌细胞和纤毛前体细胞的数量在第3天和第6天大幅增加(图B和 C)，杆状细胞(Club)和杯状细胞可能是纤毛细胞的前体(图D)。

SARS-Cov-2^hi细胞的数量和SARS-CoV-2基因百分比在第3天和第6天显著降低(图A和B)，代表了在鼻腔多纤毛细胞中 的SARS-CoV-2的复制和脱落发生在COVID-19早期。这些变化与细胞学分析显示SARS-CoV-2NP在多纤毛上皮细胞中的数量和 信号强度下降相一致(图C-E)。

作为一种测定单个细胞转录组与蛋白表达信息的新兴技术，BDRhapsody单细胞多组学平台具有高细胞通量及高分辨 率特征:100-40000个高细胞通量，同时兼备转录组、蛋白组及多样本分析技术，从多组学角度解析细胞异质性以及组 织微环境构成、发现差异表达的基因及蛋白，为临床科学研究以及生物医药发现提供新的思路以及解决方案。