CD24，也被称为热稳定抗原（HSA）或小细胞肺癌群集4抗原，是一种高度糖基化GPI-锚定的表面蛋白。能与先天免疫细胞上的siglec10相互作用，以抑制对感染、脓毒症、肝损伤和慢性移植物抗宿主病的破坏性炎症反应。

为了评估CD24–Siglec-10信号在调节巨噬细胞介导的对癌症的免疫反应中的作用，作者检查了CD24和Siglec-10在各种肿瘤和相关免疫细胞中的表达。与已知的先天免疫检查点相比，几种肿瘤中CD24表达广泛上调（图1a）。通过CD24表达对患者进行分层显示，具有较低CD24表达的卵巢癌患者的无复发生存率提高，而具有较低CD24表达的乳腺癌患者的总体生存优势（图1b-c）。作者利用来自TNB六个主要样本的单细胞RNA测序数据，研究了肿瘤内细胞水平的CD24和Siglec-10表达，三阴性乳腺癌（TNBC）细胞表现出CD24的高表达，而所有其他细胞簇则表现出较弱的CD24表达，因此说明CD24可能作为肿瘤特异性标志物（图1d）。对原发性人类肿瘤的FACS分析表明，乳腺癌细胞和卵巢癌细胞有的CD24蛋白表达，两种肿瘤类型的TAM均表达了Siglec-10（图1e-f）。

图1

为了研究CD24–Siglec-10信号在调节巨噬细胞介导的抗肿瘤免疫反应中的作用（图2a），作者设计了CD24缺陷的正常CD24阳性的MCF-7人乳腺癌细胞系的多克隆亚系（ΔCD24）。尽管未刺激的（M0）人类供体来源的巨噬细胞通过FACS表达了低水平的Siglec-10，但是添加两种抑制性细胞因子TGFβ-1和IL-10诱导了Siglec-10的强表达，表明Siglec-10的表达可能由TAM特异性基因表达程序调控。在基线时，TGFβ-1，IL-10刺激的（M2样）巨噬细胞的吞噬能力低于未刺激的巨噬细胞。用经典的M2极化细胞因子IL-4刺激也足以诱导Siglec-10表达。WT或ΔCD24细胞与表达Siglec-10的M2样巨噬细胞共培养表明，仅CD24缺失足以增强吞噬作用（图2b）。

为了通过自动活细胞显微镜测量吞噬细胞清除率，GFP + WT和ΔCD24细胞用pH敏感染料pHrodo red 标记，并与巨噬细胞共培养。在36小时内，作者发现，与WT细胞相比，ΔCD24细胞在低pH吞噬溶酶体中更容易被吞噬和降解（图2c）。Siglec-10的单克隆抗体阻断增强了巨噬细胞的吞噬能力，证实了Siglec-10在抑制吞噬作用中的作用（图2d）。为了进一步研究Siglec-10表达对吞噬作用的影响，作者敲除了供体来源的巨噬细胞中的SIGLEC10基因。作者观察到，与仅用Cas9电穿孔的细胞（Cas9对照）相比，用靶向SIGLEC10基因座的单个向导RNA（sgRNA）电穿孔后72小时，Siglec-10表达显着降低（图2e）。Siglec-10 KO巨噬细胞显示出比Cas9对照巨噬细胞显着更大的吞噬能力（图2f）。

图2

据报道，siglec10可与高度唾液化的cd24相互作用。因此，作者观察到，在表面去硅酰化后，siglec10-fc与MCF-7细胞的结合显著减少(图2g)。这表明，siglecl -10具有识别蛋白质和唾液酸配体的能力，因此可能有多种不同的配体扩展到CD24之外。然而，在没有表面唾液化的情况下，CD24缺失几乎消除了siglec10 - fc的结合，这表明CD24是siglec10的主要蛋白配体(图2h)。自动活细胞显微镜显示，用CD24阻断单抗(克隆SN3)21处理的mcf -7 phrodo - red +细胞更容易被低pH吞噬溶酶体吞噬，随着时间的推移，红色信号增强（图2i）。

同样，基于流式细胞仪的吞噬作用测量显示，与IgG对照相比，添加抗cd24单抗后，吞噬作用显著增加，大于用CD47阻断观察到的效果(图3a)。CD24阻断剂增强了所有表达CD24的癌症的吞噬作用，包括乳腺癌(MCF-7)、胰腺癌(Panc1)、胰腺神经内分泌肿瘤(APL1)和小细胞肺癌(NCI-H82)，而对CD24细胞(U-87 MG)无影响（图3b）。基因缺失导致对CD24阻断反应显著降低，表明抗CD24单抗特异性干扰CD24- siglec10信号(图3c)。CD24的表达与对CD24阻滞的反应以及基线吞噬作用水平相关，表明CD24的组织特异性表达是主要的“don’t eat me”信号，并突显了CD24表达作为先天性抗氧化剂的预测指标的潜在价值肿瘤免疫反应（图3d）。从转移性卵巢癌患者中收集卵巢癌细胞，并用抗CD24 mAb处理，以测量原发性人类肿瘤的吞噬作用（图3e）。在这些情况下，CD24阻断产生的作用明显大于CD47阻断，并且CD24和CD47阻断抗体的双重治疗至少会加重吞噬作用（图3f）。
图3 

为了研究是否可以在体内概括针对CD24赋予的抗吞噬作用的保护作用，将GFP-荧光素酶+ MCF-7 WT或MCF-7ΔCD24细胞移植到NOD.Cg-Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ（NSG）小鼠中。在数周内，作者观察到与WT肿瘤相比，ΔCD24肿瘤的肿瘤生长显着减少（图4a-b）。TAM的耗竭并没有显着改变WT肿瘤的负担，而TAM的丧失在很大程度上消除了在ΔCD24肿瘤中观察到的肿瘤生长的减少，这表明增加的TAM介导的ΔCD24细胞清除率是减轻肿瘤负担的原因（图4b）。吞噬清除率提高导致的这种生长差异为移植有CD24缺陷肿瘤的小鼠带来了显着的生存优势（图4c）。为了证明可以通过治疗性阻断CD24来调节抗肿瘤免疫力的增强，将具有已建立的MCF-7 WT肿瘤的NSG小鼠用抗CD24单克隆抗体治疗2周。与IgG对照相比，抗CD24单药疗法显着降低了肿瘤的生长（图4d）。图4 

抗CD24 mAb对人的潜在脱靶作用包括B细胞耗竭，这是由于B细胞的CD24高表达所致。确实，在用抗CD24单抗治疗后，可以观察到健康B细胞的吞噬作用清除（扩展数据图10a）。但是，作者发现与抗CD47 mAb 4不同，抗CD24 mAb并未显示出可检测到的与人红细胞（RBC）的结合，尽管小鼠CD24a是由小鼠RBC表达的（扩展数据图10b）。CD24的高表达可能会抑制对依赖巨噬细胞功能的疗法的反应，因此CD24的表达可能对现有免疫疗法的反应性具有直接的预测价值。发现弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者中CD24和CD47的表达呈负相关（扩展数据图10c）。
补充图10 

总结：
总的来说，这项工作将CD24–Siglec-10定义为对调节抗肿瘤免疫至关重要的新型先天免疫检查点，并为CD24阻断的治疗潜力提供了证据，特别是有望治疗卵巢癌和乳腺癌。

本文涉及技术： 流式细胞术

本文涉及技术： 多重免疫组化

 

本文涉及技术： 单/多因子检测