上一期软文中我们对“Immune suppressive landscape in the human esophageal squamous cell carcinoma microenvironment”一文中的图1-4进行了分析，发现在癌症细胞中CD4+、CD8+T细胞，NK细胞与临近组织相比有较明显的变化，且在肿瘤环境中存在免疫抑制。接下来我们进一步针对图5-7进行分析，主要针对巨噬和DC进行了研究。

01 、ESCC中髓细胞的功能组成不同
作者进一步进行了髓细胞的无监督聚类。鉴定出14个细胞簇，包括9个单核细胞/巨噬细胞簇和5个DC细胞簇（图5A）。Mono-C1-VCAN显示出很强的单核细胞特征（图5B），为了进一步了解细胞转变，作者使用了Monocle（一种无监督的推理方法）来构建细胞转化的潜在发展轨迹。数据显示单核细胞（Mono-C1-VCAN），M1（Macro-C1-IL6）和M2（Macro-C3-CSF1）位于分支的末端，Macro-C2-IL1RN位于中间（图5C）。接下来，作者使用WGCNA对单核细胞/巨噬细胞进行加权相关网络分析。有趣的是，作者发现Turquoise模块与单核细胞簇Mono-C1-VCAN和Mono-C2-IL1B正相关，而与M2簇Macro-C3-CSF1和MDSC簇MDSC-C1-C1QC，MDSC负相关-C2-APOE（图5D-E）。作者进一步分析了该模块中的基因及其与Mono-C1-VCAN的关联（图5F）以选择最相关的前50个基因，以形成一个集合。这一特征与ESCC存活率的高可能性密切相关（图5G），以及宫颈鳞状细胞癌和肺鳞状细胞癌也出现类似现象，这表明该标记物可作为ESCC和其他组织中鳞状细胞癌的预后生物标志物。
作者进一步应用单细胞调节网络推断和聚类（SCENIC）方法探索可能调节单核细胞M1和M2发育的转录因子。M2中的MITF，BHLHE40，ATF3和USF2被上调，而M1中的IRF转录因子（包括IRF1，IRF7，IRF2，IRF5和PRDM1）被上调。单核细胞簇中的RARA，FOSB和NFKB2大大增加（图5H）。除了S158之外，SCENIC还揭示了大多数肿瘤与相邻组织对之间的分裂（图5I）。转录因子BHLHE40在M2中特异性表达。作者进行了网络分析以鉴定BHLHE40下游基因，并通过Metascape分析了功能（图5J）。BHLHE40可能在TAMs向M2表型诱导中起关键作用，其具体机制有待进一步研究。数据表明，抑制性TAMs在ESCC微环境中的富集可能有助于疾病的进展，阐明了一些与预后相关的令人信服的TF候选基因。

五个DC簇具有高表达水平的CLEC9A，CD1C，FCER1A，LAMP3和CLEC4C，包括常规cDC1（DC-C1-CLEC9A），cDC2（DC-C2-CLEC10A），单核细胞衍生DC（DC-C4-FCER1A） ），LAMP3 + DC（DC-C3-LAMP3）和pDC（DC-C5-CLEC4C）（图6A）。与邻近组织相比，DC-C3-LAMP3富含肿瘤（图6B）。比较了DC的激活和迁移分数，发现LAMP3 + DC与其他DC子集相比具有最高的活性和迁移能力，还发现LAMP3 + DCs丰富了致耐受性的特征（图6C）。LAMP3 + DCs表达了许多调节分子，例如IDO1，EBI3，CD274和IL10（图 6D）。在进行路径富集分析时，发现LAMP3 + DC中上调的基因在细胞因子介导的信号转导，DC细胞分化，白细胞激活，膜运输，抗原加工和呈递的路径中富集（补充图10A），该DC子集支持多功能。
作者通过流式细胞仪验证了LAMP3 + DC。数据显示，与LAMP3-DC相比，LAMP3 + DC的CD83，CCR7和PDL1的表达显着更高（图 6E-F），表明LAMP3 + DCs具有成熟、迁移和调控能力。多色免疫组化染色也证实了肿瘤组织中CD11C + LAMP3 + PDL1 + IDO + DCs的存在(图6G)。有趣的是作者发现IFNγ和LPS刺激诱导DCs表达PDL1和IDO(图6H)，并在与CD4 + CD45RA + naïve T细胞共培养时诱导FOXP3表达能力增强(图6I)。提示IFNγ和LPS可诱导树突状细胞产生耐受性。此外，SCENIC分析显示DC亚群可以通过不同的转录因子组来区分(图6J)。LAMP3 + DCs表现出较高的RELB、IRF1、FOXO1和ETS1水平;CEBPD、ETS2、CEBPB、CREB5在cDC2中表达上调。BCL6、BACH1、FLI1和RUNX1在cDC1中高表达，而高水平的SPIB、IRF7和NR3C1与pDCs相关(图6J和补充图10B)。因此，作者进行了网络分析，以通过Metascape鉴定RELB下游基因。数据显示，这些基因与细胞迁移，DC分化和细胞过程的负调控有关（补充图10C-D）。这些结果表明RELB在调节tDC发展中具有重要作用。

02 、ESCC中免疫细胞间的相互作用
细胞间的通信主要通过配体-受体的相互作用，在确定TME和对治疗反应中起关键作用。因此，基于在任何两种类型的肿瘤浸润免疫细胞中的已知配体-受体对的共表达，对潜在的细胞间相互作用进行了系统分析，并在肿瘤与邻近组织之间进行了比较。由于巨噬细胞和Treg在肿瘤中的高浸润水平和重要的免疫调节作用，作者应用了scTHI（https://github.com/miccec/scTHI），这是另一种广泛用于分析巨噬细胞和Tregs相互作用的方法，发现他们中有可比的结果。
结果发现巨噬细胞和Treg之间的TNF-TNFSF1B，CCL4-CCR8和IL-1β-IL1R2相互作用具有较高的相互作用评分，并且Treg在肿瘤中表达了高水平的TNFSF1B，CCR8和IL1R2（图7A-C）。首先，通过流式细胞术分析了食管鳞癌和邻近组织的IL1R2表达，发现从肿瘤分离的Tregs中IL1R2表达高于邻近组织（补充图11A）。然后，多色IHC还验证了Tregs中的IL1R2表达（图7D）。第三，体外共培养和抗体阻断试验表明，IL1R2对于Treg抑制抑制效应细胞T的IL-1β依赖性激活（例如增殖和IFNγ表达）是必需的（图7E-F，补充图11B-C）。

作者还预测了Tregs中的MHC和巨噬细胞中的LILRB1之间的相互作用（图7G）。MHC受体LILRB1是髓样细胞活化的负调节剂，是M2抑制状态的启动子。MHC-LILRB1相互作用抑制巨噬细胞，是癌症免疫治疗的靶。首先通过scRNA-seq分析了巨噬细胞中LILRB1的表达，并通过FACS对其进行了进一步验证。发现，与邻近组织相比，ESCC巨噬细胞中LILRB1的表达增加了（图7H-I和补充图11D）。Tregs表达高水平的HLA-A，HLA-B和HLA-C（补充图11E-F）。多色IHC染色还显示了LILRB1表达巨噬细胞和Treg之间潜在的物理相互作用（共定位）（图7J）。当Tregs与巨噬细胞共培养时，作者发现Tregs促进了表达M2标记（包括CD163和PDL1）的巨噬细胞，并降低了TNFα的表达。但是，LILRB1抗体阻滞抑制了这些影响（图7K-L和补充图11G-H）。这些数据表明，Tregs可能通过HLA和LILRB1相互作用调节巨噬细胞功能，而阻断该途径可能会促进ESCC的抗肿瘤免疫力。

总结：文章从ESCC和邻近组织获得的免疫细胞转录图谱为理解免疫状态提供了框架，并揭示了ESCC环境中免疫细胞的动态特性。此外，从许多方面说明了ESCC的免疫抑制状态，所有这些都是开发ESCC和其他癌症的免疫疗法的潜在新靶标。

本文涉及技术： 流式细胞术

本文涉及技术： 多重免疫组化

 

本文涉及技术： 单/多因子检测